NEGATIEVE KLEURING: GRONDGEDACHTE, TECHNIEK, VOOR- EN NADELEN - BIOLOGIE - 2025

De negatieve kleuring is een methode van speciale kleuring om de aanwezigheid van de capsule in sommige micro-organismen , voornamelijk Streptococcus pneumoniae, Klebsiella pneumoniae en Cryptococcus neoformans-, te benadrukken van klinische monsters of zuivere culturen.

Het directe monster dat gewoonlijk wordt gebruikt om negatieve kleuring toe te passen, is cerebrospinale vloeistof. Deze techniek vormt een snel alternatief voor de vermoedelijke diagnose van meningitis, in het bijzonder Cryptococcus neoformans.

A. Tandsteen gekleurd met Oost-Indische inkt, B. Cryptococcus neoformans var gatti zwak ingekapseld zoals het in de natuur voorkomt, met behulp van nigrosine. C. Cryptococcus neoformans var gatti met een dikke capsule zoals gevonden in zijn parasitaire vorm, met behulp van nigrosine. D. Cryptococcus neoformans met licht verdunde Oost-Indische inkt. Gisell Quinde, van Wikimedia Commons / CDC, via Wikimedia Commons / Photo Credit: Content Providers (s): CDC / Dr. Leanor Haley, via Wikimedia Commons

Evenzo kan deze vlek worden aangebracht op sputum en steriele vloeistoffen in het algemeen, evenals op stammen die zijn verkregen uit jonge zuivere culturen. Deze techniek gebruikt nigrosine of Oost-Indische inkt voor de uitvoering; daarom is het een zeer eenvoudige en goedkope methodologie om toe te passen die in korte tijd informatie van grote diagnostische waarde oplevert.

In die zin is elk laboratorium in staat deze kleuring uit te voeren. Het laboratorium moet natuurlijk bekwaam personeel hebben dat in staat is om geïsoleerde of ontluikende Cryptococcus neoformans-gisten te herkennen en ze te onderscheiden van leukocyten en artefacten die het monster kan bevatten.

Basis

Nigrosine en Oost-Indische inkt werken op een vergelijkbare manier; daarom kunnen beide stoffen door elkaar worden gebruikt.

Deze techniek wordt negatieve kleuring genoemd omdat deze in strijd is met de rest van de kleuringstechnieken. Wat hierbij ongeverfd blijft, is de structuur waarnaar wordt gezocht of die men wenst te zien; dat wil zeggen, micro-organismen.

Daarom is kleuring gebaseerd op het kleuren van de onderkant van het uitstrijkje met een donkere kleur. In dit scenario zullen de ingekapselde structuren opvallen in lichte of kleurloze kleuren.

Over het algemeen zijn de gisten brekend, omgeven door een heldere halo die overeenkomt met de capsule. Dit komt doordat Oost-Indische inkt en nigrosine stoffen zijn die niet kunnen doordringen in het polysaccharide dat de capsule van levende micro-organismen vormt.

Het is vermeldenswaard dat andere structuren die in het directe monster aanwezig kunnen zijn, zoals leukocyten of rode bloedcellen, ook niet doordringen.

Als de micro-organismen echter dood zijn, kan de kleurstof erin doordringen, zodat deze kleuring ook nuttig is om de levensvatbaarheid van de micro-organismen te beoordelen.

Techniek

materialen

Nigrosine

Nigrosine dankt zijn naam aan de zwarte kleur die het heeft. Het is een synthetische stof die wordt verkregen door het verhitten van het mengsel van organische verbindingen, zoals nitrobenzine, aniline en anilinehydrochloriet, met behulp van een katalysator (ijzer of koper) in de reactie.

Chinese inkt

Chinese inkt is een stof die voornamelijk door Aziaten wordt gebruikt om te schrijven, kunstwerken te maken en monochromatisch te schilderen. Het is erg populair in de Chinese cultuur.

Het wordt verkregen uit inktvisinkt gemengd met verpulverde houtskool, het product van het verbranden van harsarme bomen.

Het is ook mogelijk om het te bereiden uit het roet van de verbranding van koolwaterstoffen (plantaardige oliën), samen met een eiwitgelatine die het de juiste consistentie geeft om het neerslaan van koolstofdeeltjes te voorkomen.

Specificaties voor bemonstering

- Het vereist geen vasten.

- Het CSF-, sputum- of steriel vloeistofmonster moet minimaal 1 ml volume bevatten en moet onmiddellijk bij kamertemperatuur naar het laboratorium worden overgebracht.

- CSF en steriele vloeistofmonsters moeten worden afgenomen door een gespecialiseerde arts.

- Het kan ook een pure cultuur zijn van een verdachte stam die verband houdt met de bovengenoemde pathogenen.

Uitvoering van de techniek met directe monsters

- De monsters moeten worden gecentrifugeerd, daarna wordt het supernatant weggegooid en wordt het bezinksel genomen.

- Een druppel van het gecentrifugeerde materiaal (sediment) en een druppel Oost-Indische inkt of nigrosine worden op een schoon objectglaasje gelegd.

- Het moet goed worden gemengd en bedekt met een dekglaasje, zodat de druppel zich als een dunne film kan verspreiden zonder over de randen te gaan.

- Vervolgens wordt het preparaat op de microscoop gemonteerd.

- Als het preparaat te donker is, kan het worden verdund met water.

Uitvoering van de techniek met stammen uit kweek

- Een heel klein deel van een jonge cultuur wordt genomen met een zaaimachine en opgelost in een druppel Oost-Indische inkt die eerder op een schoon objectglaasje is geplaatst.

- Er wordt een dekglaasje bovenop geplaatst.

- Het wordt in de microscoop waargenomen bij 10X en vervolgens bij 40X.

Je kunt ook een deel van de kolonie oplossen in gedestilleerd water, van daaruit een druppel nemen en dit mengen met de Oost-Indische inkt. Op deze manier zal de voorbereiding niet zo dik zijn, waardoor het mogelijk wordt om de structuren geïsoleerd te observeren; als er drukte is, zal het niet goed worden waargenomen.

Een andere methode is de volgende:

- Plaats een druppel van de suspensiecultuur op een uiteinde van het objectglaasje.

- Plaats een druppel nigrosine aan hetzelfde uiteinde en meng.

- Verspreid het monster met behulp van een ander glaasje alsof u een hematologisch uitstrijkje maakt.

- Laten drogen en onder de microscoop observeren.

Microscoop observatie

U moet eerst scherpstellen met een 10X objectief om een ​​breed zicht op het veld te hebben. Vervolgens moet worden gezocht of er vrije ruimtes zijn; als dat het geval is, focus dan 40X om details te zien.

Voordeel

- Het is gemakkelijk uit te voeren.

- Het is een goedkope techniek.

- Voor deze methode is het niet nodig het uitstrijkje op hitte of met chemicaliën te fixeren; daarom worden micro-organismen waargenomen zonder vervormingen.

- Het verse preparaat hoeft niet te worden gedroogd en is dus direct waarneembaar en levert snel resultaat op.

Nadeel

Eenmaal samengesteld, moeten verse bereidingen onmiddellijk in acht worden genomen; als ze mogen drogen, is het niet meer mogelijk om ze te observeren en moet er een nieuwe worden geïnstalleerd.

Weefselkleuring met Oost-Indische inkt

Een andere functie die Oost-Indische inkt kan vervullen, is in pathologielaboratoria. Dit wordt toegepast op chirurgisch geëxtraheerde weefselmonsters om de snijvlakken van de tumor te markeren.

Het gemarkeerde weefsel wordt besproeid met azijnzuur. Dit werkt als een bijtmiddel en voorkomt dat er inkt lekt wanneer het weefsel wordt onderworpen aan routinematige verwerking voor de biopsievoorbereiding.

De procedure bestaat uit het baden van het weefsel in alcohol en xyleen en het vervolgens in paraffinewas weken. Deze markering begeleidt de patholoog bij het observeren van het weefsel en geeft aan waar de chirurgische resectiemarge of een ander aandachtspunt is.

Referenties

1. «Nigrosina». Wikipedia, de gratis encyclopedie. 11 juli 2017, 22:46 UTC. 6 januari 2019, 16:56: en.wikipedia.org
2. "Chinese inkt". Wikipedia, de gratis encyclopedie. 1 okt 2018, 03:08 UTC. 6 januari 2019, 18:20: es.wikipedia.org/
3. Silva L, Silva C, Fernández N, Bueno C, Torres J, Rico M, Macías J en medewerkers. (2006). Arbeidspersoneel van de autonome gemeenschap Extremadura. Specifieke agenda Deel IV. Redactioneel MAD. Sevilla-Spanje, pp 211-212.
4. Silva M, García M, Corrales J, Ponce E. (2006). Gespecialiseerde laboratoriumtechnicus, Galicische gezondheidsdienst (SERGAS). Specifiek onderwerp agendavolume 2. Redactioneel MAD. Sevilla-Spanje, pp 79-80.
5. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. 2009. Bailey & Scott Microbiologische diagnose. 12 ed. Argentinië. Redactioneel Panamericana SA