PROTEINASE K: KENMERKEN, ENZYMATISCHE ACTIVITEIT, TOEPASSINGEN - BIOLOGIE - 2024

Het K-proteïnase is een enzym dat tot de groep van serineproteasen behoort, dwz het heeft in het midden een katalytisch actief aminozuur serine en heeft de functie om de peptidebindingen door hydrolyse te verbreken. Dit enzym behoort op zijn beurt tot de familie van subtilisine-eiwitten (peptidase S8).

Proteinase K heeft een molecuulgewicht (MW) van 28.900 dalton en werd voor het eerst geïsoleerd in 1974 in extracten van de schimmel Engyodontium-album, voorheen bekend als Tritirachium-album Limber.

Moleculaire structuur van Proteinase K. Bron: Lykchiniadis

Het heeft een hoge proteolytische capaciteit, wat wordt aangetoond door het vermogen om de aanwezige keratine in het haar af te breken. Het woord keratine in het Engels wordt gespeld als "keratine", vandaar de naam "proteïnase K".

Vanwege zijn hoge vermogen om natuurlijke eiwitten te splitsen, is dit enzym nuttig in verschillende moleculaire biologische technieken. Het wordt voornamelijk gebruikt om nucleïnezuren met een hoog molecuulgewicht (MW) te isoleren en te bereiden.

Proteinase K werkt door nucleair DNA vrij te maken, terwijl het eiwitten vernietigt en RNases en DNases inactiveert, dat wil zeggen, het elimineert nucleasen in DNA- en RNA-preparaten.

Aan de andere kant is gezien dat proteïnase K sommige gedenatureerde natuurlijke eiwitten kan hydrolyseren, wat de interesse van onderzoekers heeft gewekt voor het gebruik ervan bij de studie van prioneiwitten (PrPC).

Ondanks hun hoge proteolytische potentie zijn er echter eiwitten die resistent zijn tegen de werking van proteïnase K. Onder hen bevinden zich enkele abnormale eiwitten, prionen (PrPSc) genaamd, die geassocieerd zijn met overdraagbare spongiforme encefalopathieën.

Proteinase K-kenmerken

Proteinase K heeft een tertiaire structuur die bestaat uit drie lagen, met een β-plaat van zeven ketens tussen twee lagen helices. Omdat het tot de S8-familie van peptidasen behoort, wordt het gekenmerkt door een katalytische triade op zijn actieve plaats, waarvan de opeenvolgende volgorde (Asp, His en Ser) is, waardoor ze zich onderscheiden van andere families van peptidasen.

Dit enzym uit de groep van serineproteasen wordt gekenmerkt door het hydrolyseren van de peptidebindingen nabij de carboxylgroep van alifatische en aromatische aminozuren.

Aan de andere kant is het in staat om te werken in de aanwezigheid van bepaalde bijtende stoffen, zoals natriumdodecylsulfaat (SDS), Tris-HCL en EDTA, die worden gebruikt om de denaturatie van eiwitten te bevorderen, waardoor ze hun oorspronkelijke structuur verliezen.

Dit is een voorbereidende stap bij het voorbereiden van eiwitten voor de elektroforese-techniek. Het pH-bereik waarbij proteïnase K werkt, is vrij breed (2,0 tot 12,0), met een optimale pH tussen 7,5 en 12,0, en het iso-elektrische punt is 8,9. Zoals te zien is, is het actief tegen een zeer breed pH-bereik.

Een ander kenmerk dat opvalt aan proteïnase K is de stabiliteit bij hoge temperaturen (50 - 60 ° C).

Enzymatische activiteit

Proteinase K vereist de aanwezigheid van het calciumion, hoewel dit zijn activiteit niet beïnvloedt, als het essentieel is om zijn stabiliteit te behouden.

Om proteïnase K het substraat volledig te laten verteren, is een contacttijd van ongeveer 5 minuten tot 2 uur nodig.

In deze zin vergeleken Daza et al. Echter de zuiverheid van het DNA dat op verschillende tijdstippen van blootstelling aan proteïnase K werd verkregen, en concludeerden dat een langdurige incubatie (tot 24 uur) de kwaliteit van het DNA aanzienlijk verbetert.

Met betrekking tot de concentratie van het proteïnase K-enzym dat in de verschillende protocollen wordt gebruikt, kan echter worden gezegd dat deze zeer gevarieerd is.

Het kan worden gebruikt van zeer lage concentraties (5 µg / ml) tot concentraties van 500 µg / ml. Maar de meest voorkomende werkconcentraties variëren van 50-100 μg / ml, vooral voor eiwitvertering en nuclease-inactivering. Hoewel voor de behandeling van weefsels een concentratie van 2 mg / ml vereist is.

Toepassingen

De toepassingen zijn erg breed en kunnen als volgt worden samengevat:

-Het wordt gebruikt bij de vertering van eiwitten en DNA-extractie door verschillende methoden, zoals: uitzouten, PK-SDS, cetyl-trimethylammoniumbromide (CTAB), gemodificeerd kaliumacetaat en extractie met natriumjodide.

-Inactivering van nucleasen (RNases en DNases).

-In de in situ hybridisatietechniek (HIS), om de afgifte van nucleïnezuur te bevorderen, naast het elimineren van ongewenste eiwitten.

-Modificatie van eiwitten.

-Op onderzoeksniveau, in verschillende onderzoeken.

Voordelen van proteïnase K

Er zijn verschillende vergelijkende onderzoeken uitgevoerd tussen DNA-extractietechnieken die Proteinase K gebruiken, met andere die het niet gebruiken en die allemaal concluderen dat er grotere voordelen zijn bij het gebruik van het enzym. Voordelen zijn onder meer:

-DNA met een hoog moleculair gewicht, van hoge kwaliteit en zuiverheid wordt verkregen.

-Het geëxtraheerde DNA is tot 3 maanden stabiel.

Het geëxtraheerde DNA kan worden gebruikt in de volgende technieken: Southern blot, polymerasekettingreactie (PCR), elektroforese, onder andere.

Proteinase K-resistente eiwitten

Diverse onderzoeken hebben geconcludeerd dat prionen (abnormale toxische PrPSc-eiwitten) verschillen van PrPC (natieve) eiwitten doordat ze resistent zijn tegen de werking van proteïnase K, terwijl PrPC's gevoelig zijn voor de werking ervan.

Andere auteurs hebben beschreven dat er in de structuur van PrPSc gevoelige delen zijn en andere die resistent zijn tegen proteïnase K. Beide delen zijn echter even toxisch en infectieus.

Aan de andere kant isoleerden Bastian et al. In 1987 vier eiwitten van 28, 30, 66 en 76 kda uit een soort Spiroplasma mirum. Alle bleken resistent te zijn tegen de werking van proteïnase K en vertoonden ook een kruisreactie met enkele prionen.

Het is bekend dat deze soort cataracten en belangrijke neurologische schade kan veroorzaken en onder meer vanwege de wetenschappelijke bevindingen van Bastian is er een poging gedaan om dit micro-organisme in verband te brengen met overdraagbare spongiforme encefalopathieën.

De etiologie van deze degeneratieve neurologische pathologie wordt echter nog steeds toegeschreven aan prionen.

In die zin identificeerden en karakteriseerden Butler et al. In 1991 een klasse van eiwitten die resistent zijn tegen proteïnase K van 40 kda uit twee stammen van Mycoplasma hyorhinis. Deze ziekteverwekker treft varkens en infecteert hun weefsels, maar in dit geval was er geen kruisreactie met de geteste prionen.

Er is meer onderzoek nodig om in dit opzicht veel onbekenden op te lossen.

Referenties

1. Bastian F, Jennings R en Gardner W. 1987. Antiserum tegen scrapie-geassocieerd fibril-eiwit reageert kruislings met Spiroplasma mirum-fibril-eiwitten. J. Clin. Microbiol. 25: 2430-2431.
2. Daza C, Guillen J, Rey J, Ruiz V.Evaluatie van een DNA-extractie- en -zuiveringsmethode van formaldehyde-gefixeerd spierweefsel van niet-geïdentificeerde kadavers. Med Magazine, 2014; 22 (1): 42-49,
3. Butler G, Kotani H, Kong L, Frick M, Evancho S, Stanbridge E en Mcgarrity G. Identificatie en karakterisering van proteïnase K-resistente proteïnen in leden van de klasse mollicuten. Infection and Immunity, 1991, 59 (3): 1037-1042
4. López M, Rivera M, Viettri M, Lares M, Morocoima A, Herrera L, et al. Vergelijking van twee Trypanosoma cruzi DNA-extractieprotocollen gekweekt in axenisch medium. Rev. Peru. Med. Exp. Volksgezondheid 2014; 31 (2): 222-227. Beschikbaar op: scielo.org
5. Jiménez G, Villalobos M, Jiménez E en Palma W. Bepaling van de effectiviteit van vijf DNA-extractieprotocollen van geparaffineerd materiaal voor moleculaire studies. Rev Méd Univ Costa Rica. 2007; 1 (1): 10-19.