ZIEHL-NEELSEN-KLEURING: GRONDGEDACHTE, REAGENTIA EN TECHNIEK - BIOLOGIE - 2026

De Ziehl-Neelsen is een kleurtechniek om micro-organismen te identificeren die resistent zijn tegen alcoholzuur (ARA). De naam van deze microbiologische procedure verwijst naar de auteurs: bacterioloog Franz Ziehl en patholoog Friedrich Neelsen.

Deze techniek is een soort differentiële kleuring, wat het gebruik van verschillende kleurstoffen inhoudt om een ​​contrast te creëren tussen de structuren die u wilt observeren, differentiëren en later identificeren. De Ziehl-Neelsen-kleurstof wordt gebruikt om bepaalde soorten micro-organismen te identificeren.

Ziehl-Neelsen beits

Sommige van deze organismen zijn mycobacteriën (bijv. Mycobacterium tuberculosis), nocardia (bijv. Nocardia sp.), En sommige eencellige parasieten (bijv. Cryptosporidium parvum). Veel van de bacteriën kunnen worden geclassificeerd via een veelgebruikte techniek, een gramkleuring.

Sommige bacteriegroepen hebben echter andere methoden nodig om ze te kunnen identificeren. Technieken zoals de Ziehl-Neelsen-beits vereisen combinaties van kleurstoffen met warmte om de eerste aan de celwand te bevestigen.

Dan komt een bleekproces dat twee resultaten oplevert: weerstand of gevoeligheid voor verkleuring door zuren en alcoholen.

Basis

De grondgedachte voor deze kleuringstechniek is gebaseerd op de eigenschappen van de celwand van deze micro-organismen. De muur bestaat uit een soort vetzuren die mycolzuren worden genoemd; Deze worden gekenmerkt door zeer lange kettingen.

Wanneer vetzuren een zeer lange structuur hebben, kunnen ze kleurstoffen gemakkelijker vasthouden. Sommige bacteriegeslachten zijn erg moeilijk te kleuren door Gramkleuring, vanwege het hoge gehalte aan mycolzuren in de celwand.

De Ziehl-Neelsen-beits maakt gebruik van de fenolische verbinding carbol fuchsine, een basisbeits. Dit heeft het vermogen om te interageren met de vetzuren van de celwand, die bij kamertemperatuur wasachtig van textuur is.

Carbol-fuchsinekleuring wordt versterkt in aanwezigheid van warmte, omdat de was smelt en de kleurstofmoleculen sneller in de celwand bewegen.

Het zuur dat later wordt gebruikt, dient om cellen te verkleuren die niet waren gekleurd omdat hun wand niet voldoende verband hield met de kleurstof; daarom kan de sterkte van het zure bleekmiddel de zure kleurstof verwijderen. Cellen die deze verkleuring weerstaan, worden zuurvast genoemd.

Secundaire kleurstof

Na ontkleuring van het monster staat het in contrast met een andere kleurstof die secundaire kleurstof wordt genoemd. Over het algemeen wordt methyleenblauw of malachietgroen gebruikt.

De secundaire kleurstof kleurt het achtergrondmateriaal en zorgt zo voor contrast met de structuren die in de eerste stap werden gekleurd. Alleen verkleurde cellen nemen de tweede kleurstof op (tegenkleuring) en krijgen hun kleur, terwijl zuurvaste cellen hun rode kleur behouden.

Deze procedure wordt vaak gebruikt voor de identificatie van Mycobacterium tuberculosis en Mycobacterium leprae, die zuurvaste bacillen worden genoemd.

Reagentia

Primaire kleurstof

0,3% carbol fuchsine (gefilterd) wordt gebruikt. Deze kleurstof wordt bereid uit een mengsel van alcoholen: fenol in ethanol (90%) of methanol (95%), en in dit mengsel wordt 3 gram basische fuchsine opgelost.

Bleekoplossing

In deze stap kunnen oplossingen van 3% alcoholzuur of 25% zwavelzuur worden gebruikt.

Secundaire kleurstof (tegenkleurstof)

De kleurstof die het meest wordt gebruikt om de monsters te contrasteren, is meestal 0,3% methyleenblauw. Andere kunnen echter ook worden gebruikt, zoals 0,5% malachietgroen.

Techniek

Zuurvaste kleuringsprocedure

Maak een bacterieel uitstrijkje

Deze voorbereiding wordt gedaan op een schoon, droog objectglaasje, waarbij de voorzorgsmaatregelen voor steriliteit worden gevolgd.

Uitstrijkjes drogen

Laat het uitstrijkje drogen bij kamertemperatuur.

Verwarm het monster

Het monster moet worden verwarmd door vuur aan te brengen op de onderstaande dia. Een alcoholfixatie kan worden uitgevoerd als het uitstrijkje niet is voorbereid met sputum (behandeld met natriumhypochloriet om het witter te maken) en als het niet meteen vlekt.

M. tuberculosis wordt verwijderd met bleekmiddel en tijdens het kleuringsproces. Hittefixatie van onbehandeld sputum zal M. tuberculosis niet doden, terwijl alcoholfixatie bacteriedodend is.

Bedek de vlek

De vlek is bedekt met de carbol fuchsin-oplossing (primaire basisbeits).

Verhit de vlek

Dit wordt gedurende 5 minuten gedaan. U zou een stoomontwikkeling moeten opmerken (ongeveer 60 ° C). Het is belangrijk dat u het monster niet oververhit en verbrandt.

Met betrekking tot het verwarmen van de vlek, moet grote voorzichtigheid worden betracht bij het verwarmen van de carbol fuchsin, vooral als de kleuring wordt uitgevoerd op een bakje of een andere container waarin licht ontvlambare chemicaliën van de vorige kleuring zijn verzameld.

Er mag slechts een kleine vlam onder de objectglaasjes worden aangebracht met een vooraf aangestoken wattenstaafje dat is bevochtigd met een paar druppels zure alcohol, methanol of 70% ethanol. Gebruik geen groot wattenstaafje gedrenkt in ethanol, aangezien dit brandgevaar oplevert.

Was de vlek

Deze wasbeurt moet worden gedaan met schoon water. Als het leidingwater niet schoon is, was het uitstrijkje dan bij voorkeur met gefilterd of gedestilleerd water.

Bedek het uitstrijkje met zure alcohol

Deze zure alcohol moet 3% bedragen. De dekking wordt uitgevoerd gedurende 5 minuten of totdat het uitstrijkje voldoende verkleurd is, d.w.z. bleekroze van kleur.

Houd er rekening mee dat zure alcohol brandbaar is; daarom moet het met de grootste zorg worden gebruikt. Vermijd nabijheid van ontstekingsbronnen.

Was de vlek

Het wassen moet gebeuren met schoon, gedestilleerd water.

Bedek het uitstrijkje met een vlek

Het kan malachietgroen (0,5%) of methyleenblauw (0,3%) zijn voor 1 tot 2 minuten, gebruik de langere tijd als het uitstrijkje dun is.

Was de vlek

Opnieuw dient schoon (gedestilleerd) water te worden gebruikt.

Aftappen

De achterkant van de glijbaan moet worden schoongemaakt en de vlek moet op een afvoerrek worden geplaatst om hem aan de lucht te laten drogen (gebruik geen absorberend papier om te drogen).

Bekijk het uitstrijkje onder de microscoop

Het 100X-objectief en de immersieolie moeten worden gebruikt. Scan het uitstrijkje systematisch en leg de relevante waarnemingen vast.

Interpreteer de resultaten

Theoretisch worden micro-organismen die een roodachtige kleur krijgen, als zuurvast positief (AAR +) beschouwd.

Als de micro-organismen daarentegen blauw of groen kleuren, worden ze, afhankelijk van de kleurstof die als tegenkleurstof wordt gebruikt, beschouwd als zuurvast negatief (AAR-).

Referenties

1. Apurba, S. & Sandhya, B. (2016). Essentials of Practical Microbiology (1st ed.). Jaypee Brothers Medical Publishers.
2. Bauman, R. (2014). Microbiologie met ziekten door lichaamssysteem (4e ed.). Pearson Education, Inc.
3. Heritage, J., Evans, E. & Killington, A. (1996). Inleidende microbiologie (1st ed.). Cambridge University Press.
4. Morello, J., Granato, P. Wilson, M. & Morton, V. (2006). Laboratoriumhandboek en werkboek in de microbiologie: toepassingen voor patiëntenzorg (11e ed.). McGraw-Hill Education.
5. Vasanthakumari, R. (2007). Textbook of Microbiology (1st ed.). BI-publicaties PVT.