WRIGHT'S VLEK: GRONDGEDACHTE, MATERIALEN, TECHNIEK EN TOEPASSINGEN - BIOLOGIE - 2026

De Wright- kleuring is een kleuringstechniek die in 1902 is ontwikkeld door de Amerikaanse patholoog James Homer Wright, op basis van de Romanowsky-kleuring. Omdat de Romanowsky-vlek onstabiel was, nam Wright methanol op als oplosmiddel en fixeermiddel.

Deze kleuring is polychromatisch, wat betekent dat het meerdere kleuren genereert afhankelijk van de structuur die de kleurstof opneemt. Deze kleuringstechniek wordt op grote schaal gebruikt om differentiële aantallen witte bloedcellen uit te voeren en om de morfologie van rode bloedcellen, bloedplaatjes en leukocyten in perifeer bloed en beenmerg te bestuderen.

Diverse uitstrijkjes van perifeer bloed gekleurd met Wright's vlek. A. Acute leukemie B. Plasmodium vivax in de erytrocyt. C. Plasmodium falciparum, macrogametocyt. D. Lymfocyt

De toepassing ervan is erg belangrijk, aangezien er afwijkingen kunnen worden waargenomen in de verschillende cellijnen van het bloed, wat de diagnose van ziekten zoals leukemie of bacteriële of parasitaire infecties vergemakkelijkt.

Dit zijn misschien de meest voorkomende toepassingen waarin deze techniek wordt gebruikt, maar het zijn niet de enige. Het is ook nuttig in andere monsters dan bloed en beenmerg, zoals onder meer neusafscheiding, fecaal slijm, sputum, huidmonsters.

Rationale voor Wright's vlek

Wright's vlek is ontstaan ​​uit de vlek van Romanowsky, die bestaat uit een methylalcoholoplossing van een zure kleurstof (eosine Y) en een basische kleurstof (methyleenblauw) en hun oxidatieproducten.

Het mengsel van kleurstoffen dat in Wright's kleuring wordt gebruikt, veroorzaakt het effect dat bekend staat als Romanowsky, dat wil zeggen dat het een prachtige paarse kleur geeft aan de kernen van leukocyten en neutrofiele korrels, terwijl de rode bloedcellen roze kleuren.

De componenten die verantwoordelijk zijn voor het geven van het typische kleurengamma van Wright's kleurstof zijn blauw B en eosine Y. Het waargenomen effect hangt af van de binding van de kleurstoffen aan chemische structuren en de interacties van blauw B en eosine Y.

Zure structuren zoals nucleïnezuren, nucleaire eiwitten en reactief onrijp cytoplasma van sommige celtypen fixeren blauw B (basiskleuring).

Terwijl de basisstructuren zoals hemoglobine, de korrels van de gesegmenteerde eosinofielen, naast andere cellulaire structuren, het eosine Y (zure kleurstof) fixeren.

Het kleuringsresultaat kan worden beïnvloed door verschillende factoren, zoals de pH van de Wright-kleurstof, de buffer en de wasoplossing; evenals de kleuring en fixatietijd.

Daarom is elke stap bij de bereiding van de reagentia cruciaal en moet deze met aandacht voor elk detail worden uitgevoerd.

materialen

Wright's vlek. Voor 100 ml is het vereist:

Weeg 0,3 g Wright's kleurstof af, meet 97 ml methanol en 3 ml glycerol.

Voorbereiding

Doe de grote hoeveelheid Wright's kleurstof in een vijzel en voeg geleidelijk de glycerol toe totdat het poeder volledig is opgelost.

Vervolgens wordt de methanol toegevoegd, gemengd en in een amberkleurige fles gegoten.

Voor gebruik moet de oplossing met zachte bewegingen worden geschud en gefilterd.

Gebufferde bufferoplossing

In één liter gedestilleerd water, 3,76 g dinatrium hydrophosphate (Na ₂ HPO ₄ 2 H ₂ 0) plus 2,1 g diwaterstoffosfaat kaliumfosfaat (KH ₂ PO ₄ ) worden toegevoegd.

Meng goed totdat alle opgenomen reagentia zijn opgelost. Stel de pH in op 7,2. Giet in een glazen pot en bewaar op kamertemperatuur.

Extra materialen die nodig zijn om de kleuring uit te voeren

Daarnaast zijn er andere materialen nodig om de kleurtechniek uit te kunnen voeren, dit zijn: objectglaasjes of hoezen, kleurbrug, t-shirts met water of buffer om te wassen, een stopwatch om de kleurtijden bij te houden en wat droogmateriaal (absorberend papier, gaas of katoen).

Onderdelen van Wright's vlek

Methanol

Alcohol (methanol) dient als fixeermiddel voor het bloeduitstrijkje op het glaasje.

Het is in feite een coagulatiemiddel, reducerend, ontwaterend en fixerend reagens. Daarom is het zijn functie om eiwitten te coaguleren en onoplosbaar te maken, maar zonder ze daadwerkelijk te denatureren.

Methanol is het meest gebruikte reagens voor het fixeren van uitstrijkjes in alle laboratoria, omdat het betere resultaten geeft dan ethanol. De ideale concentratie is 99%.

Demper

De buffer (gebufferde oplossing) heeft de functie om de pH van de kleurstof aan te passen of op peil te houden, aangezien een pH van 7,2 essentieel is voor de celstructuren om de kleurstoffen goed te kunnen opnemen.

Aan de andere kant, de methanolfixatiestap dehydrateert de cellen en de buffer helpt ze te rehydrateren.

Eosine (Y)

Eosine heeft affiniteit voor bouwstenen omdat het een zure kleurstof is. Van twee soorten eosine is bekend dat ze erg op elkaar lijken, zozeer zelfs dat een van de twee kan worden gebruikt, waarbij hetzelfde resultaat wordt verkregen.

De ene wordt eosine Y, gele eosine of tetrabroomfluoresceïne genoemd, en de andere wordt eosine B, blauwachtig erythrosine B of dibromodinitrofluoresceïne genoemd. Eosine Y wordt echter het meest gebruikt.

De belangrijkste eigenschap van deze kleurstof is zijn negatieve polariteit, hierdoor wordt hij aangetrokken door positief geladen celstructuren.

Methyleenblauw

Het is de basiskleuring. De belangrijkste eigenschap is metachromasie, dat wil zeggen dat niet alle structuren dezelfde kleur krijgen, het hangt af van de chemische samenstelling van de structuren die worden gekleurd.

Sommige worden licht of donkerblauw en andere worden donkerpaars of bleek lila.

Techniek

1-Voer de spreiding van het monster uit zodat er een dunne film achterblijft, hetzij op een glaasje of op een dekglaasje.

2-Laat het ongeveer 2 uur aan de lucht drogen.

3-Plaats het droge uitstrijkje op de kleuringsbrug of kleurbak met de spreiding van het monster naar boven.

4-Bedek het vel met de Wright-vlek druppel voor druppel totdat het hele oppervlak bedekt is. Laat 5 - 8 minuten intrekken.

5-De vlek moet de dia volledig bedekken, zonder over de randen te morsen. Als het tijdens het kleuren begint te verdampen, voeg dan nog een paar druppels toe.

6-Voeg vervolgens een gelijke hoeveelheid van de schokdemper toe, blaas een beetje totdat de karakteristieke metaalglans verschijnt. Tijd 10 tot 15 minuten.

7-Was met kraanwater en plaats de zachte straal totdat het laken roze lijkt.

8-Verwijder met een gaasje gedrenkt in alcohol de kleurstof die aan de achterkant van het objectglaasje zit.

9-Laat het uitstrijkje goed drogen voordat u de immersie-olie plaatst om het onder de microscoop te bekijken.

Nut

Hematologie

Het is ideaal voor het kleuren van perifere bloeduitstrijkjes, voor het onderzoek van dikke bloeduitstrijkjes en voor het bestuderen van cellen uit beenmergmonsters.

Door de chemische eigenschappen van deze combinatie van kleurstoffen kunnen celstructuren gemakkelijk worden herkend en kunnen de verschillende soorten aanwezige cellen worden onderscheiden.

Loopneus

Deze techniek is erg handig om de cellen van de neusafscheiding (epitheelcellen, gesegmenteerde eosinofielen, polymorfonucleaire cellen) te identificeren bij de diagnose van allergische rhinitis.

parasitologie

In deze zin is het nuttig geweest voor de studie van Leishmania sp in de histiocyten van het onderhuidse celweefsel bij huidzweren. Evenzo wordt het gebruikt om leukocyten in ontlastingsmonsters te identificeren (fecaal leukogram).

In dit geval is het van belang voor de arts om te weten of de leukocytose die aanwezig is in de ontlasting polymorfonucleair of mononucleair is. Deze bevinding in het fecale leukogram zal bepalen of het respectievelijk een bacteriële of virale infectie is.

Aan de andere kant kunnen parasieten die in het bloed circuleren, worden aangetroffen in de erytrocyt of vrij in plasma. De gezochte parasieten zijn Plasmodium spp, Trypanosoma cruzii en filarias, en in de diergeneeskunde is het nuttig bij het zoeken naar Theileria equi en Babesia caballi, veroorzakers van bebesiose, vooral bij paarden.

De Wright-kleuring en ook de Giemsa-kleuring maken het mogelijk hemoparasieten te onderscheiden van normale cellulaire componenten. Hiervoor kunnen twee soorten spreads worden gebruikt:

Verspreid dun

Bloed wordt als een dunne film op een objectglaasje uitgespreid. Het is gekleurd met Wright's kleurstof, waardoor de kenmerken van de kern en het cytoplasma worden onthuld.

Dikke druppel

Deze methodiek wordt gebruikt om de aanwezigheid van parasieten in een grotere hoeveelheid bloed te onderzoeken.

Om dit te doen, wordt een grote druppel bloed op een glaasje geplaatst. Eenmaal daar, moet het worden gedefibrilleerd, waarbij steeds grotere cirkels worden gemaakt vanuit het midden naar buiten, met behulp van de rand van een andere dia.

Om ten slotte de parasieten in het dikke uitstrijkje te kunnen waarnemen, moeten de erytrocyten met water worden gelyseerd.

Luchtweginfecties

Op respiratoir niveau is deze techniek ook nuttig, omdat de cellen die aanwezig zijn in de monsters van sputum, bronchiale spoeling of bronchoalveolair, belangrijk zijn voor het stellen van de diagnose.

Evenzo kunnen hier polymorfonucleaire cellen en mononucleaire cellen worden onderscheiden.

Bacteriologie

Het gebruik van deze techniek in de bacteriologie is beperkt, omdat het niet goed is voor het kleuren van bacteriën, daarom worden andere gespecialiseerde kleurtechnieken gebruikt voor hun kleuring.

Het is echter gebruikt om te zoeken naar epitheelcellen met inclusielichamen van Chlamydia trachomatis in urethrale of endocervicale mucosa-uitstrijkjes, hoewel het moet worden erkend dat dit niet de beste methode hiervoor is.

Het is ook mogelijk om spiraalachtige bacteriën zoals Borrelia burgdorferi waar te nemen tussen rode bloedcellen bij geïnfecteerde patiënten, evenals morulae of inclusielichamen van Ehrlichia sp in het cytoplasma van lymfocyten, monocyten of neutrofielen in een bloeduitstrijkje.

Mycologie

Histoplasma capsulatum is een pathogene schimmel die vaak wordt gediagnosticeerd door microscopische observatie van verschillende weefselmonsters, gekleurd met Wright's kleurstof.

Hoe worden de structuren van het bloedmonster waargenomen met de Wright-vlek?

Bron: Retamales E, Mazo V. Instituut voor Volksgezondheid, regering van Chili. Aanbevelingen voor het kleuren van bloeduitstrijkjes voor het lezen van het hemogram.

Aanbevelingen voor een goede kleuring

Objectglaasjes voor bloedmonsters moeten spontaan aan de lucht drogen. Uitstrijkjes moeten zo dun mogelijk zijn om een ​​betere fixatie van de kleurstof te krijgen en overkleuring te voorkomen.

Voor een hoogwaardige kleuring is het raadzaam om binnen twee uur na voorbereiding van het uitstrijkje te kleuren. Aan de andere kant is het ideale monster capillair bloed, zonder antistollingsmiddel.

Als veneus bloed wordt gebruikt, moet het echter worden gebruikt als anticoagulans EDTA en niet als heparine, aangezien dit laatste celstructuren kan vervormen.

Om bederf van de bereide kleurstof te voorkomen, moet deze op droge plaatsen worden bewaard.

Tijdens het wasproces wordt het gebruik van water met een pH-neutraal aanbevolen.

Ten slotte is het raadzaam om de kleuringsmethoden die in het laboratorium worden gebruikt van tijd tot tijd te testen.

Dit wordt gedaan door monsters of uitgebreide patronen te kleuren als kwaliteitscontrole. Deze stap is belangrijk, omdat het ervoor zorgt dat de kleuring goed wordt voorbereid en de kleuringstijden goed gestandaardiseerd zijn.

Als het patroonvel slecht gekleurd is, zijn er problemen die moeten worden opgelost.

Veelgemaakte fouten bij Wright-kleuring

Zeer bleke vlekken

Zeer bleke uitstrijkjes zijn meestal te wijten aan een zeer korte kleuringstijd of overmatig wassen. Dit wordt gecorrigeerd door de contacttijd met de kleurstof te verlengen of de wastijd te verkorten.

Kleurstof slaat neer

De aanwezigheid van neerslag van kleurstof in het uitstrijkje kan verschillende oorzaken hebben, maar de meest voorkomende oorzaken zijn: gebruik van ongefilterde kleurstof, vlekken op oneffen vlekbruggen, gebruik van vellen die vuil zijn met stof of vet, niet goed wassen volledige kleuring.

Extreem rood of blauw uitstrijkje

De buffer is verantwoordelijk voor de pH van de kleurstof. Kleurstoffen met een pH lager dan aangegeven (zuur) zullen resulteren in zeer roodachtige uitstrijkjes.

Als de pH van de kleurstof hoger is dan (alkalisch), wordt een extreem blauwachtige vlek verkregen.

Opslagmodus

Het reagens moet bij kamertemperatuur worden bewaard.

Referenties

1. Gutiérrez V. Vergelijkende studie tussen de Wright-kleuringsmethode en de Elisa-test voor de diagnose van Ehrlichiose bij honden in de stad San Pedro Sula, Honduras. 2008. Afstudeerscriptie om in aanmerking te komen voor de opleiding Diergeneeskunde. Universiteit van San Carlos van Guatemala.
2. López-Jácome L, Hernández-Durán M, Colín-Castro C, Ortega-Peña S, Cerón-González G, Franco-Cendejas F. Basiskleuren in het microbiologisch laboratorium. Onderzoek naar handicap. 2014; 3 (1): 10-18.
3. "Wright's vlek." Wikipedia, de gratis encyclopedie. 18 mei 2018, 12:05 UTC. 8 december 2018, 20:37
4. Calderón A, Cardona J, Vergara Ó. Frequentie van Babesia spp. bij het jagen op paarden, Córdoba (Colombia). Rev. udcaactual onthullend. 2013; 16 (2): 451-458.
5. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A (2009). Bailey & Scott Microbiologische diagnose. 12 ed. Argentinië. Redactioneel Panamericana SA
6. Retamales E, Mazo V. Instituut voor Volksgezondheid Regering van Chili. Aanbevelingen voor het kleuren van bloeduitstrijkjes voor het lezen van het hemogram.