MAY GRÜNWALD-GIEMSA VLEK: GRONDGEDACHTE, TECHNIEK EN TOEPASSINGEN - BIOLOGIE - 2025

De May Grünwald-Giemsa of Pappenheim- kleuring is een differentiële kleuringstechniek die Giemsa en May Grünwald-reagentia mengt. Het wordt gebruikt voor de differentiatie van normale en abnormale bloedcellen in uitstrijkjes van perifeer bloed en beenmerg, en voor het kleuren van histologische coupes en cytologische monsters.

Beide reagentia -Giemsa en May Grünwald- zijn afgeleid van Romanowsky-achtige kleuring, een techniek die is gebaseerd op de combinatie van zure en basische kleurstoffen.

Uitstrijkje met een gesegmenteerde neutrofiel en een milleocyt in een geval van chronische myeloïde leukemie, gekleurd met de May Grünwald Giemsa-kleuring. Dr Ramon Simon-Lopez (https://es.m.wikipedia.org/wiki/Archivo:LMC-1.JPG) via Wikipedia.org.

Giemsa verbeterde de techniek door het mengsel van eosine, methyleenblauw en hun derivaten te stabiliseren met glycerol. In plaats daarvan gebruikt May Grünwald eosine en methyleenblauw, met methanol als oplosmiddel. Deze strategische combinatie heeft uitstekende resultaten opgeleverd.

Hoewel het wat betreft de observatie van celmorfologie op een vergelijkbare manier werkt als de Giemsa- en Wright-kleuringen, verbetert deze techniek de vorige door de kleuring van de parasieten die malaria, de ziekte van Chagas, leishmaniasis en trichomoniasis veroorzaken te verfijnen.

Bovendien is het een zeer nuttige techniek gebleken voor de cytologische studie van zaadvloeistof. Het onderscheidde zich niet alleen door de morfologische kenmerken van sperma te tonen, maar ook door de differentiatie van leukocyten, epitheelcellen en spermatogenese cellen met grote efficiëntie mogelijk te maken.

Basis

De techniek volgt de basis van Romanowsky-kleurstoffen, waarbij zure kleurstoffen een selectieve affiniteit hebben voor basische cellulaire componenten en zure componenten basische vlekken aantrekken.

Op een andere manier uitgelegd: zowel celstructuren als kleurstoffen hebben positieve of negatieve elektrische ladingen; gelijke ladingen stoten elkaar af en verschillende ladingen trekken elkaar aan.

Basische kleurstoffen zoals methyleenblauw zijn bijvoorbeeld positief geladen en worden aangetrokken door negatief geladen structuren. Daarom kleurt deze kleurstof de kernen die rijk zijn aan DNA en RNA met negatief geladen fosfaatgroepen.

De korrels van gesegmenteerde basofielen en de cytoplasma's van RNA-bevattende mononucleaire witte bloedcellen worden ook gekleurd.

Evenzo heeft de zure kleurstof een negatieve lading, daarom bindt deze zich aan positief geladen structuren zoals erytrocyten en korrels van gesegmenteerde eosinofielen. Wat betreft de korrels van gesegmenteerde neutrofielen, deze fixeren beide kleurstoffen.

Verscheidenheid aan kleurstoffen

Bij deze techniek bestaat een combinatie van reacties tussen orthochromatische en metachromatische kleurstoffen naast elkaar. Orthochromatica (eosine en methyleenblauw) binden zich aan de celstructuur waarmee ze verband houden en zorgen voor een stabiele kleur die niet varieert.

Aan de andere kant variëren de metachromaten (de derivaten van methyleenblauw azuur A en azuur B) hun oorspronkelijke kleur zodra ze aan de specifieke structuur zijn gehecht, en er kunnen zelfs verschillende tinten zijn.

Ten slotte vereist de stap die de May Grünwald-oplossing neemt de aanwezigheid van water, omdat zonder dit de kleurstof de structuren zal doordringen maar niet zal fixeren. Om dit te laten gebeuren, moet de kleurstof polair worden of ioniseren, en dus kunnen neerslaan en zich kunnen binden aan verwante structuren.

Techniek

materialen

- Schuif dia's.

- Bruggen van kleur.

- May-Grünwald-oplossing.

- Giemsa-vlek.

- Gedistilleerd water.

May Grünwald kleurstof geconcentreerde oplossing

0,25 g eosine-methyleenblauw (vlek volgens May Grünwald) moet worden afgewogen en opgelost in 100 ml methanol. Daarna wordt het preparaat 1 uur gemengd en 24 uur laten rusten. Aan het einde van de tijd wordt het gefilterd.

Om de techniek toe te passen, moet de May Grünwald-kleurstof als volgt worden verdund: meet voor 200 ml verdunde kleurstof 30 ml van de geconcentreerde oplossing, voeg 20 ml bufferoplossing en 150 ml gedestilleerd water toe, ingesteld op pH 7,2-7,3 . Later wordt het gemengd en gefilterd.

Giemsa-kleurconcentraat

0,5 g azuur-eosine-methyleenblauw (kleurstof volgens Giemsa) moet worden afgewogen, opgelost in 50 ml methanol en 50 ml glycerine aan het mengsel worden toegevoegd.

Om de techniek uit te voeren, 1:10 verdunnen met bufferoplossing en 10 minuten laten rusten. Het kan indien nodig worden gefilterd.

Bereiding van de bufferoplossing bij pH 7,2

Ze moeten worden gewogen:

- 40 mg kaliumdiwaterstoffosfaat (KH2PO4).

- 151 mg dinatriumwaterstoffosfaat 12-hydraat (Na2HPO4).

Beide verbindingen worden opgelost in 100 ml water.

Procedure voor het kleuren van bloed- of beenmerguitstrijkjes

Er zijn twee modi: een klassieker en een snelle.

Klassieke modus

1. Bedek de uitstrijkjes gedurende 2 tot 3 minuten met de verdunde May-Grünwald-oplossing.
2. Was met gebufferd gedestilleerd water om de vorige oplossing te verwijderen.
3. Dek af met dezelfde gebufferde wasoplossing en laat 1 minuut staan. Het idee is dat de vorige kleurstof zich aan de structuren bindt en tegelijkertijd de cellen hydrateert.
4. Voeg 12 druppels verdunde Giemsa-tinctuur toe aan het gebufferde water en blaas om te mengen en homogeniseer. Laat het 15 tot 20 minuten rusten.
5. Was de uitstrijkjes met gebufferd gedestilleerd water en laat ze aan de lucht drogen.
6. Focus en bekijk de gekleurde bloedcellen onder een lichtmicroscoop met behulp van de 40X-doelstelling. Indien nodig kan de 100X worden gebruikt.

Snelle modus

1. Bedek het uitstrijkje gedurende 1 minuut met verdunde May Grünwald-beits.
2. Was met gebufferd gedestilleerd water.
3. Dek af met gebufferd water en laat 1 minuut rusten.
4. Voeg de verdunde Giemsa-vlek toe en laat 5 minuten staan.
5. Was met gebufferd gedestilleerd water en laat aan de lucht drogen.

De hier beschreven technieken zijn een richtlijn, maar er moet rekening mee worden gehouden dat de procedures en kleuringstijden variëren naargelang het commerciële bedrijf dat de reagentia distribueert. Het is raadzaam om de stappen te volgen die strikt worden aangegeven door elk handelshuis.

Techniek voor het kleuren van uitstrijkjes van zaadvloeistof

1- Bedek het uitstrijkje met een dunne laag van de May Grünwald-oplossing gedurende 4 minuten.

2- Verwijder de kleurstof en was met gedestilleerd water.

3- Leg een laag verdunde Giemsa (1:10) 15 minuten in gedestilleerd water.

4- Verwijder de kleurstof en was met gedestilleerd water.

5- Laat drogen en observeer onder de microscoop.

Verwachte kleuren met de May Grünwald Giemsa-beits

Belangrijke specificaties

De techniek vereist dat de reagentia en wasoplossingen een pH hebben die is ingesteld op 7,2 -7,3, zodat de affiniteiten van de kleurstoffen voor de celstructuren niet worden verstoord en de verwachte uiteindelijke kleur niet varieert.

Toepassingen

Deze techniek wordt gebruikt door klinische laboratoria om uitstrijkjes van perifeer bloed en beenmerg, weefselcoupes en cytologieën te kleuren.

Op hematologisch gebied is deze techniek van vitaal belang bij de studie van afwijkingen van cellen in termen van vorm, grootte en aantal. Het is een zeer waardevol hulpmiddel voor de diagnose van bepaalde ziekten, zoals leukemie en anemie.

Bovendien is het van buitengewoon nut bij het zoeken naar parasieten in de hematologische (Plasmodium sp en Trypanosoma cruzi) of histologische (Leishmanias sp) gebieden.

Vaginale cytologie

Met betrekking tot vaginale cytologie is deze techniek vooral voordelig voor de observatie van Trichomonas vaginalis. Dit is een belangrijke bevinding, aangezien de aanwezigheid ervan carcinoombeelden in situ simuleert die later verdwijnen wanneer de parasiet wordt geëlimineerd.

Spermastaal

Het is een ideaal hulpmiddel geweest voor de studie van spermastalen, omdat het waardevolle informatie geeft over de kwaliteit van het sperma.

De data die het biedt hebben vooral te maken met aantal en morfologie, maar ook met de daarbij aanwezige cellen die van levensbelang zijn, zoals kiemcellen, leukocyten en epitheelcellen.

Met deze analyse is het mogelijk om waargenomen afwijkingen in het sperma in het hoofd, nek, middenstuk en hoofdstuk te beschrijven.

Bovendien kunnen ze ook helpen bij het aantonen van gevallen van hemospermie (aanwezigheid van rode bloedcellen in sperma) en leukospermie of piospermie (verhoogd aantal leukocyten in sperma).

Referenties

1. Costamagna S, Prado M. Validatie van de nieuwe test, May Grünwald-Giemsa en Gram-kleuringen en voedingsbodems voor de diagnose van Trichomonas vaginalis. Parasitol. 2001; 25 (1-2): 60-64. Verkrijgbaar in: scielo.
2. Merck KGaA-laboratorium. May Grünwald eosine methyleenblauw voor microscopie.
3. "May-Grünwald-Giemsa-vlek." Wikipedia, de gratis encyclopedie. 15 november 2018, 14:37 UTC. 8 januari 2019, 04:29: en.wikipedia.org
4. Glass Chemicals Panreac Laboratory. Reagentia voor histologische technieken, hematologie en microbiologie. Verkrijgbaar bij: glasschemicals.com
5. Retamales E, Manzo V. Aanbeveling voor het kleuren van bloeduitstrijkjes om het hemogram te lezen. Nationaal en referentie biomedisch laboratorium. Instituut voor Volksgezondheid van Chili.
6. Sarabia L. Spermiogram volgens WHO-criteria. Programma voor ontwikkelingsanatomie en biologie. Medische faculteit. Universiteit van Chili. Beschikbaar op: pp.centramerica.com