GIEMSA-KLEURING: GRONDGEDACHTE, MATERIALEN, TECHNIEK EN TOEPASSINGEN - BIOLOGIE - 2026

De Giemsa-kleuring is een soort kleurende klinische monsters, gebaseerd op het mengsel van zure en basische kleurstoffen. De creatie ervan was geïnspireerd op het werk van Romanowsky, waar Gustav Giemsa, een chemicus en bacterioloog oorspronkelijk uit Duitsland, het perfectioneerde door glycerol toe te voegen om de verbindingen te stabiliseren.

De veranderingen die werden gegenereerd in de originele Romanowsky-techniek maakten het mogelijk de microscopische waarnemingen aanzienlijk te verbeteren, daarom werd de techniek gedoopt met de naam Giemsa-vlek.

Diverse monsters gekleurd met Giemsa-kleurstof. A. Trypanosoma evansi in perifeer bloed. B. Normale bloedcellen. C. Borrelia theileri in perifeer bloed. D. Burkitt-lymfoom.

Omdat het een eenvoudige techniek is om uit te voeren, zeer functioneel en economisch, wordt het momenteel veel gebruikt in het klinische laboratorium voor hematologische uitstrijkjes, beenmergmonsters en weefselcoupes.

De Giemsa-kleuringstechniek is erg handig voor cytologische studies, omdat het de observatie van specifieke celstructuren mogelijk maakt. Deze techniek kleurt de cytoplasma's, kernen, nucleoli, vacuolen en granules van cellen, waardoor zelfs fijne sporen van chromatine kunnen worden onderscheiden.

Bovendien kunnen significante veranderingen in de grootte, vorm of kleur van de kern worden gedetecteerd, waarbij het mogelijk is om het verlies van de kern-cytoplasma-relatie te visualiseren.

Aan de andere kant maakt het het mogelijk om onrijpe cellen in beenmerg en perifeer bloed te identificeren, wat belangrijk is voor de diagnose van ernstige ziekten zoals leukemie. Het is ook mogelijk om onder meer hemoparasieten, extra en intracellulaire bacteriën, schimmels te detecteren.

In de cytogenetica wordt het veel gebruikt, omdat het mogelijk is om de mitose van cellen te bestuderen.

Basis van Giemsa-kleuring

Kleurstoffen van het Romanowsky-type zijn gebaseerd op het gebruik van een contrast tussen zure en basische kleurstoffen om respectievelijk de basische en zure structuren te kleuren. Zoals te zien is, is er een affiniteit van zure kleurstoffen om basisstructuren te kleuren en vice versa.

De gebruikte basiskleurstof is methyleenblauw en zijn geoxideerde derivaten (Azure A en Azure B), terwijl de zure kleurstof eosine is.

De zuurstructuren van de cellen zijn de nucleïnezuren, onder andere de korrels van de gesegmenteerde basofielen, daarom worden ze gekleurd met methyleenblauw.

In dezelfde zin zijn de basisstructuren van cellen hemoglobine en sommige korrels, zoals die in onder meer gesegmenteerde eosinofielen; deze worden gekleurd met eosine.

Aan de andere kant, vanwege het feit dat methyleenblauw en azuurblauw worden gekenmerkt door metachromatische kleurstoffen, kunnen ze een variabele tint geven aan de verschillende structuren in overeenstemming met de hoeveelheid polyanionen die ze bezitten.

Dit is hoe de strategische combinatie van basische en zure kleurstoffen erin slaagt om een ​​breed spectrum van kleuren te ontwikkelen, volgens de biochemische kenmerken van elke structuur, door lichtblauwe, donkerblauwe, lila en paarse tinten te lopen in het geval van zuurstructuren.

Hoewel de kleuring van eosine stabieler is, genereert het kleuren tussen roodachtig oranje en zalm.

materialen

Materialen voor het bereiden van de stamoplossing

Voor de bereiding van de voorraadoplossing moet 600 mg verpoederde Giemsa-kleurstof worden afgewogen, 500 cc acetonvrije methylalcohol en 50 cc neutrale glycerine worden afgemeten.

Hoe de stamoplossing te bereiden

Doe het zware Giemsa-poeder in een vijzel. Als er klontjes zijn, moeten deze worden bespoten. Voeg vervolgens een aanzienlijke hoeveelheid van de afgemeten glycerine toe en meng goed. Het verkregen mengsel wordt in een zeer schone amberkleurige fles gegoten.

De rest van de glycerine wordt in de vijzel gedaan. Meng opnieuw om de rest van de kleurstof die aan de wanden van de mortel is gehecht schoon te maken en giet in dezelfde pot.

De fles wordt afgesloten en gedurende 2 uur in een waterbad van 55 ° C geplaatst. Schud het mengsel voorzichtig elk half uur terwijl het in een waterbad staat.

Vervolgens laat men het mengsel afkoelen om de alcohol te plaatsen. Eerder werd een deel van de afgemeten alcohol in de mortel gedaan om het wassen van de resterende kleurstof af te maken en vervolgens wordt het samen met de rest van de alcohol aan het mengsel toegevoegd.

Dit preparaat moet minimaal 2 weken rijpen. Het gebruikte deel van de stockoplossing moet worden gefilterd.

Om besmetting van het preparaat te voorkomen, wordt aanbevolen om de portie die constant wordt gebruikt over te brengen naar een klein amberkleurig flesje met een druppelaar. Vul elke keer bij als het reagens op is.

Materialen om de bufferoplossing te bereiden

Aan de andere kant wordt een bufferoplossing met pH 7,2 als volgt bereid:

6,77 g natriumfosfaat (watervrij) (NaHPO ₄ ), 2,59 g kaliumdiwaterstoffosfaat (KH ₂ PO ₄ ) en gedestilleerd water afgewogen tot 1000 cc.

Laatste voorbereiding van de kleurstof

Voor de bereiding van de uiteindelijke kleuroplossing, meet 2 ml van de gefilterde stockoplossing en meng met 6 ml van de bufferoplossing. Roer het mengsel.

Een relevant feit waarmee rekening moet worden gehouden, is dat de kleurvoorbereidingstechnieken kunnen veranderen afhankelijk van de commerciële woning.

Extra materialen die nodig zijn om de kleuring uit te voeren

Afgezien van de beschreven materialen, moet u kleurbruggen hebben, t-shirts met water of buffer om te wassen, objectglaasjes of hoezen voor objecten, een stopwatch om de kleurtijden te regelen en vloeipapier of materiaal dat kan worden gebruikt om te drogen ( gaas of katoen).

Techniek

Kleuringsproces

1) Voorafgaand aan het kleuren, moet het uitstrijkje van het monster klaar zijn op een schoon objectglaasje.

De monsters kunnen bloed, beenmerg, histologische weefselcoupes of cervico-vaginale monsters zijn. Het wordt aanbevolen dat de smeersels dun zijn en 1 of 2 uur drogen voordat ze kleuren.

2) Leg op een kleurbrug alle vellen die gekleurd moeten worden. U werkt altijd in dezelfde volgorde en elk blad is goed herkenbaar.

3) Breng een paar druppels methylalcohol (methanol) 100% aan op het uitstrijkje en laat dit 3 tot 5 minuten inwerken om het monster te fixeren en te dehydrateren.

4) Gooi de methanol op de plaat weg en laat aan de lucht drogen.

5) Eenmaal droog, plaats de laatste kleuroplossing met een druppelaar totdat het hele vel bedekt is. Laat 15 minuten inwerken. Sommige auteurs bevelen maximaal 25 minuten aan. Het hangt af van het bedrijfshuis.

6) Giet de vlek af en was het uitstrijkje met gedestilleerd water of met een 7.2-bufferoplossing.

7) Laat de vellen op een vloeipapier in de open lucht drogen, verticaal gerangschikt met behulp van een steun.

8) Maak de achterkant van de objectglaasjes schoon met een alcoholdoekje of wattenstaafje om eventuele vlekken te verwijderen.

Gereedschap

De Giemsa-kleuringstechniek wordt op verschillende gebieden gebruikt, waaronder: hematologie, mycologie, bacteriologie, parasitologie, cytologie en cytogenetica.

Hematologie

Deze vlek wordt het meest gebruikt. Hiermee kan elk van de cellen die aanwezig zijn in beenmerg- of perifere bloedmonsters worden geïdentificeerd. Naast het schatten van het aantal van elke serie, het kunnen detecteren van leukocytose of leukopenie, trombocytopenie, enz.

Omdat het gevoelig is voor het identificeren van onrijpe cellen, is het relevant bij de diagnose van acute of chronische leukemieën. Het is ook mogelijk om de diagnose bloedarmoede te stellen, zoals onder meer sikkelcelanemie, sikkelcelanemie.

Mycologie

In dit gebied wordt het vaak gebruikt om te zoeken naar Histoplasma capsulatum (intracellulaire dimorfe schimmel) in weefselmonsters.

Bacteriologie

Bij hematologische uitstrijkjes gekleurd met Giemsa is het mogelijk Borrelias sp te detecteren bij patiënten die de ziekte vertonen die terugkerende koorts wordt genoemd. Spirocheten zijn er in overvloed onder erytrocyten, in monsters genomen tijdens het hoogtepunt van koorts.

Het is ook mogelijk om intracellulaire bacteriën zoals Rickettsia sp en Chlamydia trachomatis in geïnfecteerde cellen te visualiseren.

parasitologie

Op het gebied van parasitologie heeft Giemsa-kleuring het mogelijk gemaakt om parasitaire ziekten zoals malaria, de ziekte van Chagas en leishmaniasis te diagnosticeren.

In de eerste twee zijn respectievelijk Plasmodium sp- en Trypanosoma cruzi-parasieten te zien in het perifere bloed van geïnfecteerde patiënten, ze kunnen in verschillende stadia worden aangetroffen, afhankelijk van het stadium van de ziekte.

Om het zoeken naar parasieten in het bloed te verbeteren, wordt aanbevolen om de Giemsa-kleurstof gemengd met de May-Grünwald-kleurstof te gebruiken.

Evenzo kan cutane leishmaniasis worden gediagnosticeerd door Giemsa-gekleurde huidbiopsiemonsters te evalueren waar de parasiet wordt aangetroffen.

Cytologie

Giemsa-kleuring wordt ook gebruikt voor de cytologische studie van endocervicale monsters, hoewel dit niet de meest gebruikte techniek voor dit doel is.

Maar in geval van schaarste aan middelen kan het worden gebruikt, met een functionaliteit die vergelijkbaar is met die van de Papanicolaou-techniek en tegen lagere kosten. Het vereist echter deskundigheid van de examinator.

Cytogenetica

Een relevant kenmerk van Giemsa-kleuring is het vermogen ervan om sterk te binden aan adenine- en thyminerijke gebieden van DNA. Hierdoor kan DNA worden gevisualiseerd tijdens celmitose, in verschillende toestanden van condensatie.

Deze studies zijn nodig om chromatische aberraties zoals duplicaties, deleties of translocaties van de verschillende regio's van de chromosomen op te sporen.

Onderzoek dat de werkzaamheid van Giemsa-kleuring aantoont

Cannova et al (2016) vergeleken 3 kleurtechnieken voor de diagnose van cutane leishmaniasis.

Hiervoor gebruikten ze monsters die waren verkregen van een proefdier (Mesocrisetus auratus) dat experimenteel was geïnoculeerd met Leishmania.

De auteurs toonden aan dat de Giemsa-kleuring beter was dan de Pap-mart® en Gaffney-kleuring. Daarom beschouwden ze de Giemsa-kleuring als ideaal voor het diagnosticeren van cutane leishmaniasis.

De uitstekende resultaten die door de auteurs zijn verkregen, zijn te danken aan het feit dat de combinatie van kleurstoffen waaruit het Giemsa-mengsel bestaat, de nodige voorwaarden biedt om een ​​gunstig contrast te creëren, waardoor de structuren van amastigoten duidelijk kunnen worden onderscheiden, zowel intracellulair als extracellulair.

De andere technieken (Pap-mart® en Gaffney) deden het ook, maar op een zwakkere manier en daarom moeilijker te visualiseren. Daarom wordt de Giemsa-kleuring aanbevolen voor de parasitologische diagnose van leishmaniasis.

Evenzo evalueerde een studie van Ramírez et al (1994) de validiteit van Giemsa- en Lendrum-kleuringen in conjunctivale uitstrijkjes voor de identificatie van Chlamydia trachomatis.

De auteurs stelden vast dat Giemsa en Ledrum-kleuringen dezelfde specificiteit hebben, maar Giemsa bleek gevoeliger te zijn.

Dit verklaart waarom Giemsa-kleuring momenteel het meest wordt gebruikt voor de diagnose van chlamydia-infecties, vooral als er weinig middelen zijn.

Bron: PanReac Applichem ITW-reagentia. Giemsa-vlek. Versie 2: JMBJUL17 CEIVD10ES. Castellar del Vallés, Spanje.

Aanbevelingen voor een goede kleuring

Het drogen van de platen mag niet worden versneld. Er moet een redelijke hoeveelheid tijd worden verwacht om het in de open lucht te drogen. Ongeveer 2 uur.

Kleur onmiddellijk na 2 uur voor het beste resultaat.

Om de uitstrijkjes beter te laten fixeren en te kleuren, moet het monster zo op het objectglaasje worden verdeeld dat er een dunne en uniforme laag achterblijft.

Het bloedmonster dat de voorkeur heeft, is het capillair, aangezien het uitstrijkje rechtstreeks van de bloeddruppel wordt gemaakt en het monster daarom geen toevoegingen bevat, wat het behoud van cellulaire structuren bevordert.

Als veneus bloed wordt gebruikt, moet EDTA echter worden gebruikt als antistollingsmiddel en niet als heparine, aangezien heparine cellen gewoonlijk vervormt.

Veelgemaakte fouten bij Giemsa-kleuring

In de praktijk kunnen kleurfouten gemaakt worden. Ze worden bewezen door plotselinge veranderingen in de tonaliteit van de structuren.

Extreem blauwe kleur

Het kan te wijten zijn aan:

• Zeer dikke uitstrijkjes
• Overschrijding van de kleuringstijd
• Was onvoldoende.
• Gebruik van reagentia ruim boven de neutrale (alkalische) pH.

Onder deze omstandigheden worden de kleuren van de volgende structuren vervormd, zodanig dat de erytrocyten in plaats van zalmroze kleuring groen zullen lijken, de korrels van de eosinofielen die steenrood gekleurd moeten worden, zullen blauwachtig of grijs worden enzovoort. afwijking in de gebruikelijke tonen.

Overmatig roze kleur

Het kan te wijten zijn aan:

• Onvoldoende kleuringstijd.
• Langdurig of overmatig wassen.
• Slechte droging.
• Gebruik van sterk zure reagentia.

In dit specifieke geval zullen structuren die normaal blauw kleuren, bijna niet zichtbaar zijn, terwijl structuren die roze kleuren sterk overdreven tinten hebben.

Voorbeeld: Erytrocyten worden helderrood of sterk oranje, nucleair chromatine wordt bleekroze en eosinofiele korrels kleuren diep helderrood.

Aanwezigheid van neerslag in het uitstrijkje

De oorzaken kunnen zijn:

• Gebruik vuile of slecht gewassen films.
• Laat het uitstrijkje niet goed drogen.
• De bevestigingsoplossing te lang laten staan.
• Onvoldoende wassen aan het einde van de kleuring.
• Onvoldoende filtratie of geen filtratie van de gebruikte kleurstof.

Aanwezigheid van morfologische artefacten

Morfologische artefacten kunnen in uitstrijkjes verschijnen, waardoor het moeilijk wordt om de aanwezige structuren te visualiseren en te interpreteren. Dit is te wijten aan:

• Type anticoagulans dat wordt gebruikt, zoals heparine.
• Gebruik van vuile, versleten of vette films.

Opslagmodus

Na bereiding moet de kleurstof op kamertemperatuur (15 - 25 ° C) worden bewaard om te voorkomen dat de kleurstof neerslaat. Het moet worden bewaard in een goed gesloten amberkleurige container.

Referenties

1. Cannova D, Brito E en Simons M. Evaluatie van kleurtechnieken voor de diagnose van cutane Leishmaniasis. Salus. 2016; 20 (2): 24-29.
2. PanReac Applichem ITW-reagentia. Giemsa-vlek. Versie 2: JMBJUL17 CEIVD10ES. Castellar del Vallés, Spanje.
3. Clark G. Staining procedures (1981), 4thed. Williams & Willkins.
4. Toegepaste klinische chemie. Giemsa-kleuring voor in vitro diagnostiek. Distributeur: cromakit.es
5. Ramírez I, Mejía M, García de la Riva J, Hermes F en Grazioso C. Geldigheid van Giemsa- en Lendrum-vlekken in conjunctivale uitstrijkjes voor de identificatie van Chlamydia trachomatis. Bol van Sanit Panam. 1994; 116 (3): 212-216.
6. Casas-Rincón G. Algemene mycologie. 1994. 2e editie Centrale Universiteit van Venezuela, bibliotheekuitgaven. Venezuela Caracas.
7. "Giemsa-vlek." Wikipedia, de gratis encyclopedie. 1 september 2017, 01:02 UTC. 6 december 2018, es.wikipedia.org.