SPOREKLEURING: GRONDGEDACHTE, TECHNIEKEN EN TOEPASSINGEN - BIOLOGIE - 2026

De sporenkleuring is de methode die wordt gebruikt om de resistentiestructuren te kleuren die in ongunstige omstandigheden bacteriegeslachten vormen; Deze structuren komen overeen met een vorm van overleven.

Er zijn veel geslachten die sporen vormen; de belangrijkste zijn echter Bacillus en Clostridium. Deze geslachten worden als relevanter beschouwd omdat ze pathogene soorten voor mensen hebben.

Sporenkleuring volgens de Shaeffer-Fulton- of Wirtz-Conklin-methode. En tambe (originele uploader), van Wikimedia Commons

Elke bacil kan een sporen veroorzaken. Op het moment dat het preparaat wordt gekleurd, bevindt de sporen zich binnen de bacil (endospore) of daarbuiten (exospore). Met conventionele kleuringstechnieken voor bacteriën - zoals de Gramkleuring - blijven de sporen kleurloos.

Momenteel zijn er verschillende kleuringsmethoden die in staat zijn om de dikke structuur van de sporen te penetreren om deze te verven. Deze methodieken zijn zeer gevarieerd; Deze omvatten de Dorner-techniek, de Möeller-vlek en de Shaeffer-Fulton-methodologie, ook bekend als Wirtz-Conklin.

Van alle genoemde technieken wordt de Shaeffer-Fulton-methodologie het meest gebruikt in routinelaboratoria. Het is genoemd naar twee microbiologen die de kleuring in 1930 hebben gemaakt: Alicia Shaeffer en MacDonald Fulton. De techniek wordt echter soms Wirtz-Conklin genoemd, naar twee bacteriologen uit de jaren 1900.

Basis

De sporen kleuren niet met conventionele vlekken omdat ze een erg dikke wand hebben. De complexe samenstelling van de sporen verhindert het binnendringen van de meeste kleurstoffen.

Als de sporen van buiten naar binnen worden bestudeerd, worden de volgende lagen waargenomen: ten eerste is er het exosporium, de dunste en buitenste laag die bestaat uit glycoproteïnen.

Vervolgens komt de cuticula, die weerstand biedt tegen hoge temperaturen, gevolgd door de cortex die is samengesteld uit peptidoglycaan. Later is de wand van de basis die de protoplast beschermt.

De sporen zijn een gedehydrateerde structuur die 15% calcium en dipicolinezuur bevat. Daarom zijn de meeste technieken voor het kleuren van sporen afhankelijk van de toepassing van warmte, zodat de kleurstof de dikke structuur kan binnendringen.

Als de sporen eenmaal zijn gekleurd, kan deze de kleurstof niet verwijderen. Bij de Shaeffer-Fulton-techniek dringt malachietgroen de vegetatieve cellen binnen en, wanneer warmte wordt toegepast, dringt het zowel de endospore als de exosporen binnen.

Door te wassen met water wordt de kleurstof uit de vegetatieve cel verwijderd. Dit komt doordat de malachietgroene kleurstof een beetje basisch is en dus zwak bindt aan de vegetatieve cel.

In plaats daarvan kan het niet uit de sporen komen en uiteindelijk wordt de bacil tegengekleurd met safranine. Deze basis geldt voor de rest van de technieken, waarin iets soortgelijks gebeurt.

Spore-kleuringstechnieken

Om de sporenkleuring uit te voeren, moet een zuivere cultuur van de te onderzoeken verdachte stam worden verkregen.

De cultuur wordt 24 uur aan extreme temperaturen onderworpen om het micro-organisme te stimuleren tot sporenvorming. Hiervoor kan de cultuur gedurende 24 of 48 uur in een oven op 44 ° C of in een koelkast (8 ° C) worden geplaatst.

Als het te lang bij de genoemde temperaturen wordt gelaten, worden alleen exosporen waargenomen, aangezien alle endosporen de bacil al hebben verlaten.

Aan het einde van de tijd moeten een paar druppels steriele fysiologische oplossing op een schoon objectglaasje worden geplaatst. Vervolgens wordt een klein deel van de kweek genomen en wordt er een fijne spread gemaakt.

Daarna wordt het gedroogd, in de hitte gefixeerd en geverfd met een van de onderstaande technieken:

Dorner-techniek

1- Bereid in een reageerbuis een geconcentreerde suspensie van het gesporuleerde micro-organisme in gedestilleerd water en voeg een gelijk volume gefilterde Kinyoun carbol fuchsine toe.

2- Plaats de buis 5 tot 10 minuten in een bad met kokend water.

3- Meng op een schoon objectglaasje een druppel van de vorige suspensie met een druppel 10% waterige nigrosine-oplossing, gekookt en gefilterd.

4- Verspreid en droog snel met zachte hitte.

5- Onderzoek met een 100x objectief (immersie).

De sporen kleuren rood en de bacteriecellen zien er bijna kleurloos uit tegen een donkergrijze achtergrond.

Gewijzigde Dorner-techniek

1- Een suspensie van het gesporuleerde micro-organisme wordt uitgespreid op een objectglaasje en gefixeerd in de hitte.

2- Het monster wordt bedekt met een strook filtreerpapier waaraan carbol fuchsin is toegevoegd. De kleurstof wordt gedurende 5 tot 7 minuten verwarmd met de vlam van de bunsenbrander totdat er dampen ontstaan. Vervolgens wordt het papier verwijderd.

3- Het preparaat wordt gewassen met water en vervolgens gedroogd met absorberend papier.

4- Bedek het uitstrijkje met een dunne film van 10% nigrosine, gebruik een tweede glaasje om de nigrosine of een naald te verspreiden.

De door de sporen en bacteriën opgenomen kleuring is dezelfde als beschreven in de stand van de techniek.

Shaeffer - Fulton of Wirtz-Conklin-techniek

1- Maak een fijne uitstrijkje met een suspensie van het gesporuleerde micro-organisme op een glaasje en fixeer het op verhitting.

2- Bedek het objectglaasje met 5% malachietgroene waterige oplossing (u kunt een filterpapier op het objectglaasje leggen).

3- Verhit boven de vlam van de bunsenbrander om dampen te laten vrijkomen en de vlam te verwijderen. Herhaal de handeling gedurende 6 tot 10 minuten. Als de malachietgroene oplossing tijdens de procedure te veel verdampt, kan er meer worden toegevoegd.

4- Verwijder het filterpapier (indien aanwezig) en was het met water.

5- Bedek het objectglaasje met 0,5% waterig safranine gedurende 30 seconden (sommige varianten van de techniek gebruiken 0,1% waterig safranine en laten dit 3 minuten staan).

Met deze techniek lijken de sporen groen en de bacillen rood.

Het nadeel is dat de endosporen van jonge culturen niet goed kleuren, omdat ze er extreem helder of kleurloos uitzien. Om dit te voorkomen, wordt aanbevolen om culturen van 48 uur incubatie te gebruiken.

Möeller-techniek

1- Bedek het uitstrijkje gedurende 2 minuten met chloroform.

2- Gooi de chloroform weg.

3- Dek af met 5% chroomzuur gedurende 5 minuten.

4- Was met gedestilleerd water

5- De plaat is bedekt met carbol fuchsin-fenicada en wordt blootgesteld aan de vlam van de bunsenbrander totdat er dampen vrijkomen; daarna wordt het even uit de vlam verwijderd. De bewerking wordt herhaald totdat 10 minuten zijn voltooid.

6- Wassen met water.

7- Gebruik aangezuurde ethanol (zoutzuur alcohol) om te verkleuren. Het blijft 20 of 30 seconden staan.

8- Wassen met gedestilleerd water.

9- Contrasteer het door het laken gedurende 5 minuten met methyleenblauw te bedekken.

10- Was met gedestilleerd water.

11- Laat het drogen en het monster wordt naar de microscoop gebracht.

De sporen zijn rood en de bacillen blauw. Het is belangrijk om de dampen niet in te ademen, aangezien deze giftig zijn en op lange termijn kankerverwekkend kunnen zijn.

Gemodificeerde Möeller-techniek zonder warmte

In 2007 creëerden Hayama en zijn medewerkers een wijziging van de Möeller-techniek. Ze elimineerden de stap van het verwarmen van de kleurstof en vervingen deze door 2 druppels van de oppervlakteactieve stof Tergitol 7 toe te voegen voor elke 10 ml carbol-fuchsine-carbol-oplossing. Dezelfde resultaten werden verkregen.

Toepassingen

De kleuring van sporen levert zeer waardevolle en nuttige informatie op voor de identificatie van de ziekteverwekker, aangezien de aanwezigheid, de vorm, de locatie binnen de bacil en het vermogen om de vegetatieve cel al dan niet te vervormen, gegevens zijn die de soort kunnen leiden. betrokken binnen een bepaald genre.

In deze context is het de moeite waard om te zeggen dat de sporen rond of ovaal kunnen zijn, ze kunnen zich in het midden bevinden of ook in een paracentrale, subminale of terminale positie.

Schema van de vorm en positie van endosporen en exosporen

Voorbeelden

- Clostridium difficile vormt een ovale sporen in een terminale positie die de bacil vervormt.

- De sporen van Clostridium tertium zijn ovaal, vervormen de bacil niet en bevinden zich op terminaal niveau.

- De endospore van Clostridium tetani is terminaal en vervormt de bacil, waardoor het lijkt op een drumstick.

- De sporen van Clostridium botulinum, C. histolyticum, C. novy en C. septicum zijn rond of subterminaal ovaal en vervormen de bacil.

- De endospore van Clostridium sordelli bevindt zich in de centrale positie, met een lichte vervorming.

Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Microbiologische diagnose. (5e ed.). Argentinië, Redactie Panamericana SA

Referenties

1. Hayama M, Oana K, Kozakai T, Umeda S, Fujimoto J, Ota H, Kawakami Y. Voorstel van een vereenvoudigde techniek voor het kleuren van bacteriële sporen zonder warmte toe te passen - succesvolle wijziging van de methode van Moeller. Eur J Med Res.2007; 16 12 (8): 356-9.
2. Wikipedia-bijdragers. Moeller vlek. Wikipedia, de gratis encyclopedie. 3 november 2018, 03:28 UTC. Beschikbaar op: en.wikipedia.org
3. Pérez R, Juárez M, Rodríguez (2011). Laboratoriumhandleiding voor microbiologische technieken. Afdeling Basiswetenschappen Academie voor Microbiologie. Nationaal Polytechnisch Instituut.
4. "Endospore." Wikipedia, de gratis encyclopedie. 25 februari 2018, 10:20 UTC. 10 januari 2019, 02:42: en.wikipedia.org
5. Silva L, Silva C, Fernández N, Bueno C, Torres J, Rico M, Macías J en medewerkers. (2006). Arbeidspersoneel van de autonome gemeenschap Extremadura. Specifieke agenda Deel IV. Redactioneel MAD. Sevilla-Spanje, pp 211-212.
6. Silva M, García M, Corrales J, Ponce E. (2006). Gespecialiseerde laboratoriumtechnicus, Galicische gezondheidsdienst (SERGAS). Specifiek onderwerp agendavolume 2. Redactioneel MAD. Sevilla-Spanje, pp 79-80.
7. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Microbiologische diagnose. (5e ed.). Argentinië, Redactie Panamericana SA
8. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. 2009. Bailey & Scott Microbiologische diagnose. 12 ed. Argentinië. Redactioneel Panamericana SA