De TCBS-agar is een middel voor zeer selectieve en differentiële vaste kweek, die wordt gebruikt voor het isoleren en kweken van bacteriën van het geslacht Vibrio, in het bijzonder Vibrio cholerae, V. parahaemolyticus en V. vulnificus als belangrijke pathogenen van deze soort.
Het acroniem TCBS staat voor Thiosulfate Citrate Bile Sucrose. Deze agar staat ook bekend als een selectief medium voor Vibrios. De originele formule is gemaakt door Nakanishi en later aangepast door Kobayashi.
Commercieel TCBS-medium en TCBS-agarplaat bezaaid met Vibrio cholerae. Bron: foto 1: gemaakt door de auteur MSc. Marielsa Gil / Foto 2: Microrao, JJMMC, Davangere, Karnataka, India
Het is samengesteld uit gistextract, vleespepton, tripteïne, natriumcitraat, natriumthiosulfaat, ossengal, sucrose, natriumchloride, ijzercitraat, broomthymolblauw, thymolblauw en agar.
Deze samenstelling maakt een adequate ontwikkeling van Vibrio-soorten mogelijk uit water-, voedsel- en ontlastingsmonsters; met uitzondering van Vibrio hollisae, die niet op dit medium groeit. Bovendien is TCBS-medium in staat de groei van andere begeleidende bacteriën, met name coliformen, te remmen.
Vanwege de ernstige gastro-intestinale en extra-intestinale problemen die sommige soorten van het Vibrio-geslacht veroorzaken, is de diagnose erg belangrijk. Mensen raken voornamelijk besmet door het eten van rauw of onvoldoende verhit voedsel uit de zee of vervuild water, maar ook door wondinfectie.
Daarom moeten klinische laboratoria TCBS-agar opnemen in de ontlastingskweekstudie van vloeibare ontlastingsmonsters, vooral met het verschijnen van rijstwater. Vooral als de patiënt aangeeft in contact te zijn geweest met zeewater of schaaldieren of vis te hebben gegeten.
Basis
Gistextract, vleespeptonen en tripteïne zijn de voedingsbronnen van dit medium. TCBS-agar is echter een onherbergzaam medium voor de meeste bacteriën.
De hoge selectiviteit wordt verkregen door de toevoeging van natriumcitraat en ossengal; beide zijn remmende middelen die ook een alkalische pH aan het medium verschaffen, de groei van de begeleidende flora beperken en de groei van onder andere V. cholerae bevorderen. Opgemerkt moet worden dat Vibrio cholerae erg gevoelig is voor zuurgraad.
Natriumchloride van zijn kant brengt het medium osmotisch in evenwicht. Bovendien werkt het, aangezien het een hoge concentratie heeft, ook als een remmend middel en bevordert het de groei van halofiele bacteriën.
Sucrose is de fermenteerbare suiker die, samen met de broomthymolblauw en thymolblauw pH-indicatoren, het medium zijn differentiële karakter geven. Om deze reden is het met dit medium mogelijk om sucrose-fermenterende stammen te onderscheiden van niet-fermenterende stammen.
Kolonies van sucrose-fermenterende stammen worden geel van kleur en zullen het medium van groen in geel veranderen als gevolg van zuurproductie. De niet-fermentoren worden doorschijnend en het medium blijft de originele kleur (groen).
Evenzo bevat dit medium natriumthiosulfaat als een bron van zwavel en ijzercitraat als ontwikkelmiddel. Beide tonen bacteriën die waterstofsulfide (kleurloos gas) kunnen produceren. H 2 S wordt gevormd uit thiosulfaat en vervolgens vormt zich na reactie met ijzercitraat een zichtbaar zwart neerslag.
Ten slotte is de agar wat zorgt voor de solide consistentie van het medium.
Voorbereiding
Weeg 89 g van het gedehydrateerde medium af en los op in een liter gedestilleerd water. Helpt oplossen door verwarming en veelvuldig roeren. Het mengsel kan maximaal 2 minuten worden gekookt.
Dit medium is niet geautoclaveerd. Na oplossen wordt het direct op steriele borden geserveerd. Als ze stollen, worden ze omgekeerd op bloedplaatjes gerangschikt en tot gebruik in de koelkast (2-8 ° C) bewaard.
Het medium na bereiding moet op pH 8,6 ± 0,2 blijven.
De kleur van het gedehydrateerde medium is lichtbeige of groenachtig beige, en de kleur van het medium is bosgroen of blauwachtig groen.
Het is belangrijk om de platen te laten opwarmen voordat u de monsters zaait.
Gebruik
Het meest voorkomende exemplaar voor Vibrios-isolatie is diarree-ontlasting.
Ontlastingsmonsters, als ze niet onmiddellijk op het selectieve medium kunnen worden gezaaid, moeten op het Cary Blair-medium worden vervoerd.
Om de gevoeligheid van de kweek te verhogen, kunnen de feces maximaal 8 uur als verrijkingsmedium door peptonwater met pH 8,4 worden geleid, van daaruit wordt het doorgekweekt naar het TCBS-medium.
Er moet ook rekening mee worden gehouden dat sommige stammen van Vibrios bloedvergiftiging kunnen veroorzaken bij patiënten met immunosuppressie, daarom kunnen ze worden geïsoleerd uit bloedkweken. Evenzo kunnen monsters van water en voedsel uit de zee worden geanalyseerd wanneer er epidemische uitbraken van de cholera-ziekte zijn.
Gezaaid
Het inoculum van het studiemonster moet opvallend zijn, het zaaien wordt uitgevoerd door middel van de stripmethode door uitputting. De platen worden 24 uur geïncubeerd bij 37 ° C in aerobiose.
De vermoedelijke kolonies van Vibrio cholerae zijn middelgroot, glad, ondoorzichtig, met dunne randen en geel van kleur als gevolg van de fermentatie van sucrose.
De soorten V. alginolyticus, V. fluvialis, V. hareyi, V. cincinnatiensis, V. furnissii, V. metschnikovii en sommige V. vulnificus groeien op een vergelijkbare manier. Andere klinisch belangrijke Vibrios-soorten zoals V. parahaemolyticus fermenteren geen sucrose en ontwikkelen zich als olijfgroene kolonies.
TCBS-agarplaat bezaaid met Vibrio parahaemolyticus. Bron: isis325 Flickr
Aan de andere kant moet in gedachten worden gehouden dat sommige stammen van Aeromonas en Plesiomonas die oxidase (+) zijn, in dit medium kunnen groeien en gele kolonies kunnen ontwikkelen die de arts in verwarring kunnen brengen. Terwijl sommige stammen van Pseudomonas ook oxidase (+) groeien als groene kolonies zoals V. parahaemolyticus.
Beperking
De oxidase-test die positief is voor het Vibrio-geslacht, mag nooit worden uitgevoerd uit kolonies die zijn verkregen uit TCBS-agar, omdat het verkregen resultaat een vals-negatief zal zijn. Verbindingen in het midden interfereren sterk met deze test. Daarom moet het worden gemaakt van subculturen op bloedagar.
QA
Om te bewijzen dat het medium in goede staat verkeert, is het raadzaam om bekende of gecertificeerde controlestammen te zaaien en te kijken of de groei voldoet aan de verwachte kenmerken.
Hiervoor kun je stammen gebruiken van:
-Vibrio cholerae -– bevredigende groei (gele kolonies, doorschijnende rand).
-Vibrio parahaemolyticus --– bevredigende groei (kolonie met groen centrum en doorschijnende rand).
-Vibrio alginolyticus ATCC 17749 - bevredigende groei (gele kolonies met halo's van dezelfde kleur rond de kolonie).
-Enterococcus faecalis ATCC 29212 - totale of gedeeltelijke remming (kleine gele of doorschijnende kolonies).
-Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853-– gedeeltelijke of totale remming (blauwe kolonies).
-Escherichia coli ATCC 25922 - Volledig geremd.
-Proteus mirabilis ATCC 43071 -– Totale of gedeeltelijke remming. (Kleine kolonies groene midden doorschijnende rand).
Incubatie van niet-geïnoculeerd medium moet ongewijzigd blijven.
Referenties
- Difco Francisco Soria Melguizo Laboratoria. TCBS-agar. 2009 Beschikbaar op: f-soria.es
- BD Laboratorium. BD. TCBS Agar 2003 Beschikbaar op: bd.com
- Britannia Laboratories. TCBS-medium. 2015 Beschikbaar op: britanialab.com
- Acumedia Laboratoria. TCBS Agar. 2016 Beschikbaar op: foodsafety.neogen.com
- Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Bailey & Scott Microbiologische diagnose. 12 ed. Redactioneel Panamericana SA Argentina.
- Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Microbiologische diagnose. 5e druk. Redactioneel Panamericana SA Argentina.