STANDAARD AGARPAREL: GRONDGEDACHTE, BEREIDING EN GEBRUIK - BIOLOGIE - 2026

De standaardtellingsagar is een vast, niet-selectief kweekmedium, ontworpen voor het kwantificeren van de aërobe microbiële belasting die aanwezig is in monsters van drinkwater, afvalwater, zuiveldranken en andere voedingsmiddelen. Dit medium is ook bekend als PCA-agar, naar het acroniem in het Engels Plate Count Agar. Het werd in 1953 gemaakt door Buchbinder, Baris en Goldstein.

Het standaard agarmedium is samengesteld uit gistextract, tripteïne, glucose, agar en gedestilleerd water. Deze formulering bevat basisvoedingselementen die de ontwikkeling van de huidige aerobe microbiële belasting mogelijk maken, niet veeleisend.

Decimale verdunningen voor het tellen van CFU's in standaard agar-tellingen. Bron: Quentin Geissmann

Omdat het medium geen remmers bevat, kunnen bacteriën zonder enige beperking groeien, waardoor het ideaal is voor algemene kolonie-telling. De plaquekwantificeringstechniek zal echter niet alle aanwezige bacteriën detecteren, maar alleen die welke in staat zijn om te groeien onder de omgevingsomstandigheden waaraan de gezaaide standaardtellingagar wordt onderworpen.

In die zin probeert de plaatkwantificatietechniek in het algemeen de hoeveelheid bacteriën van het aërobe mesofiele type te bepalen, dat wil zeggen die bacteriën die groeien bij temperaturen tussen 25 en 40 ° C, met een optimale groeitemperatuur van 37 ° C. .

Deze bacteriegroep is erg belangrijk, omdat daar de meeste ziekteverwekkende bacteriën voor de mens worden aangetroffen.

Opgemerkt moet worden dat het soms interessant kan zijn om de hoeveelheid psychrofiele bacteriën in voedsel te kwantificeren. Deze bacteriën groeien bij lage temperaturen (<20 ° C) en zorgen ervoor dat voedsel sneller wordt afgebroken, zelfs in de koelkast.

Evenzo kunnen thermofiele bacteriën, die zich ontwikkelen in een bereik van 50 ° C tot 80 ° C of meer, belangrijk zijn in bepaalde soorten voedsel, zoals ingeblikt voedsel.

Microbiële kwantificering wordt uitgedrukt in kolonievormende eenheden (CFU) per gram of milliliter monster.

Basis

Het standaard telmedium is ontworpen om de succesvolle groei van niet-kieskeurige aërobe bacteriën mogelijk te maken, aangezien gistextract, tripteïne en glucose de nodige voedingsstoffen leveren voor een goede microbiële groei.

Aan de andere kant heeft het medium een ​​lichte kleur en een transparant uiterlijk, daarom is het ideaal voor de visualisatie van kolonies die zijn ontwikkeld door de deep seeding-methode (plaatgieten).

Het tellen van kolonies door middel van de Drigalski spatel-oppervlaktezaaimethode is ook mogelijk.

Wanneer de microbiële belasting hoog is, moeten decimale verdunningen van het studiemonster worden gemaakt om de CFU's te kunnen tellen.

Opgemerkt moet worden dat dit medium wordt aanbevolen door de American Public Health Association (APHA) voor het tellen van aërobe mesofielen.

Voorbereiding

Weeg 23,5 g van het gedehydrateerde medium af en los op in een liter gedestilleerd water. Om volledig op te lossen, moet het mengsel worden verwarmd door regelmatig te roeren tot het kookt. De volgende stappen zijn afhankelijk van de te gebruiken zaaitechniek.

Voor de gietplaattechniek

Verdeel door 12 tot 15 ml in reageerbuizen te verdelen. Steriliseer vervolgens gedurende 15 minuten in een autoclaaf bij 121 ° C. Laat verticaal stollen in de vorm van een blok. Bewaar in de koelkast tot gebruik.

Smelt de plug wanneer je hem gaat gebruiken. Eenmaal gesmolten, bewaar het in een waterbad van 44-47 ° C terwijl de monsters worden voorbereid.

Voor oppervlakte zaaien

Steriliseer het medium in een autoclaaf bij 121 ° C en verdeel vervolgens 20 ml in steriele petrischalen. Laten stollen, omkeren en tot gebruik in de koelkast bewaren.

Tempereerplaten voor gebruik. De pH van het medium moet 7,0 ± 0,2 zijn.

Gebruik

Standard Count Agar wordt gebruikt in de aërobe mesofiele teltechniek tijdens microbiologische analyse van water en voedsel. Het tellen van de aërobe mesofielen is noodzakelijk, aangezien dit de hygiënische kwaliteit van het onderzochte monster bepaalt.

De toepassing van deze techniek (met behulp van dit medium) maakt de macroscopische visualisatie van geïsoleerde kolonies mogelijk voor hun kwantificering.

Plaatstorttechniek (diepte zaaien)

-Werkwijze

De techniek bestaat uit het volgende:

1) Homogeniseer het monster om de aanwezige bacteriën te herverdelen.

2) Een eerste suspensie wordt gemaakt in een steriele fles of zak, waarbij de verhouding van 10 g of 10 ml monster in 90 ml verdunningsmiddel ( ^10-1 ) wordt gerespecteerd .

3) Vanaf de initiële suspensie worden de relevante decimale verdunningen gemaakt, afhankelijk van het type monster. Vb: ( ^10-2 , ^10-3 , ^10-4 ). Verdunningen worden gemaakt met peptonwater of fosfaatbuffer.

Om dit te doen, neemt u 1 ml van de oorspronkelijke suspensie en plaatst u deze in 9 ml verdunningsmiddel, zet de verdunning indien nodig voort, neem nu 1 ml van de ^10-2 verdunning enzovoort.

4) Neem 1 ml van elke verdunning en doe dit in lege steriele petrischalen.

5) Voeg aan elke plaat 12 tot 15 ml standaard agar toe, vooraf gesmolten en bezonken bij 44-47 ° C.

6) Draai de platen voorzichtig om het monster gelijkmatig over de agar te verdelen en te laten stollen.

7) Keer de platen om en incubeer 24 tot 48 uur bij 37 ° C in aerobiose.

8) Aan het einde van de tijd worden de platen onderzocht en de kolonies geteld in de verdunning die dit toelaat. Die platen met tussen de 30 en 300 CFU worden gekozen voor de telling.

Het tellen kan handmatig worden gedaan of u kunt de kolonie-tellerapparatuur gebruiken.

De toegestane waarden per ml monster kunnen van land tot land verschillen, afhankelijk van de regelgeving waaronder ze vallen.

-Berekening van UFC

De algemene berekening wordt gedaan met behulp van de volgende formule:

Formule voor de algemene berekening van de kwantificering van CFU's. Bron: National Administration of Medicines, Food and Medical Technology (ANMAT). Microbiologische analyse van voedsel, officiële analytische methodologie, indicatormicro-organismen. 2014 Deel 3. Beschikbaar op: anmat.gov.ar

Druk de resultaten uit in 1 of 2 cijfers, vermenigvuldigd met de juiste grondtal 10. Voorbeeld: als het resultaat 16.545 is, wordt het afgerond op basis van het derde cijfer naar 17.000 en wordt het als volgt uitgedrukt: 1,7 x 10 ⁴ . Nu, als het resultaat was 16.436, omheen tot 16.000 en een automatische 1,6 x 10 ⁴ .

Oppervlakte zaaitechniek

-Werkwijze

-Inocular met 0,1 ml van het monster direct als het vloeibare, suspensie initiële 10 ^-1 of de opeenvolgende verdunningen 10 ^-2 , 10 ^-3 etc, in het midden van een standaardtelling agarplaat.

- Verdeel het monster gelijkmatig met een Drigalski spatel of een L-vormige glazen staaf en laat 10 minuten rusten.

-Keer de platen om en incubeer aëroob bij 37 ° C gedurende 24 tot 48 uur.

-Ga verder met het tellen van de kolonies, kies die platen die in een bereik tussen 20 - 250 CFU liggen.

-Berekening van UFC

Voor de berekening wordt de verdunningsfactor toegepast, die het omgekeerde is. Het getal wordt afgerond op 2 significante cijfers (afronding volgens het derde cijfer) en wordt uitgedrukt in de macht van grondtal 10. Als bijvoorbeeld 224 CFU zonder verdunning in het monster wordt geteld ( ^10-1 ), wordt 22 x 10 ¹ CFU gerapporteerd , maar als het aantal 225 was, wordt 23 x 10 ¹ CFU gerapporteerd.

Nu, als 199 CFU worden meegeteld in de 10 ^-3 verdunning , 20 x 10 ⁴ CFU zal worden gerapporteerd, maar als 153 CFU worden meegeteld in dezelfde verdunning, 15 x 10 ⁴ CFU zal worden gerapporteerd.

QA

Het standaardtellingskweekmedium kan worden geëvalueerd met behulp van bekende gecertificeerde stammen, zoals: Escherichia coli ATCC 8739, Staphylococcus aureus ATCC 6538, Bacillus subtilis ATCC 6633, Lactobacillus fermentum ATCC 9338, Staphylococcus epidermidis ATCC 12228, Shigella flexneri ATCC 12022.

Als het kweekmedium in optimale omstandigheden verkeert, wordt in alle gevallen een bevredigende groei verwacht, behalve L. fermentum, die een regelmatige opbrengst kan hebben.

Om de steriliteit van het kweekmedium te beoordelen, moeten een of twee platen van elke bereide batch (zonder inoculatie) gedurende 24 uur bij 37 ° C in aerobiose worden geïncubeerd. Na deze tijd mag er geen groei of kleurverandering in het medium worden waargenomen.

Beperkingen

-Smelt de agar niet meer dan één keer.

-Het bereide medium kan tot 3 maanden meegaan, zolang het in de koelkast wordt bewaard en beschermd tegen licht.

-Dit medium is niet geschikt voor veeleisende of anaërobe micro-organismen.

Referenties

1. Nationale administratie van geneesmiddelen, voeding en medische technologie (ANMAT). Microbiologische analyse van voedsel, officiële analytische methodologie, indicatormicro-organismen. 2014 Deel 3. Beschikbaar op: anmat.gov.ar
2. Laboratorios Difco Francisco Soria Melguizo, SA Plate Count Agar. 2009 Beschikbaar op: http://f-soria.es
3. Conda Pronadisa Laboratoria. Standaardmethode Agar (PCA) volgens APHA en ISO 4833. Beschikbaar op: condalab.com
4. Britannia Laboratories. Agarplaat tellen. 2015 Beschikbaar op: britanialab.com
5. Camacho A, Giles M, Ortegón A, Palao M, Serrano B en Velázquez O. 2009. Technieken voor microbiologische analyse van voedingsmiddelen. 2e ed. Faculteit Chemie, UNAM. Mexico. Verkrijgbaar bij: depa.fquim.unam