RECOMBINANT DNA: TECHNIEK, TOEPASSINGEN EN GRONDBEGINSELEN - BIOLOGIE - 2026

Het recombinante DNA (rDNA of rDNA) is een kunstmatig nucleïnezuurmolecuul dat in het laboratorium is gemaakt door twee segmenten van belangengroepen te integreren. Het is ook bekend als chimeer DNA, dankzij zijn hybride eigenschap. Dit type DNA komt in de natuur niet voor.

De basismethodologie om het te genereren omvat: (a) de selectie van een doelwit-DNA en het inbrengen ervan in een ander DNA-fragment (in het algemeen een bacterieel plasmide); (b) de introductie van dit plasmide in een bacterie, (c) de selectie van de bacteriën door middel van antibiotica en tenslotte (d) de expressie van het gen.

Bron: pixabay.com

De techniek maakt gebruik van een set enzymen die het mogelijk maken om naar het oordeel van de onderzoeker specifieke DNA-fragmenten te kopiëren en te plakken.

Het doel van recombinante technologie is in de meeste gevallen de expressie van een eiwit (bekend als een recombinant eiwit) gewenst door de moleculair bioloog voor toekomstig onderzoek of om een ​​eiwit te creëren met commerciële en therapeutische waarde - zoals humane insuline, bijvoorbeeld.

Basisprincipes van de recombinant-DNA-techniek en het gebruik ervan in genetische manipulatie

Het centrale dogma van moleculaire biologie

Alle organische wezens die we kennen, delen verschillende kenmerken. Een daarvan is de aard van het genetisch materiaal en de manier waarop eiwitten worden gemaakt - een proces dat bekend staat als het centrale 'dogma' van de moleculaire biologie.

Met uitzondering van een paar virussen, slaan alle organismen genetische informatie op in DNA (deoxyribonucleïnezuur), dat op een zeer compacte en georganiseerde manier verzameld is in de celkern.

Voor genexpressie wordt het DNA-molecuul getranscribeerd in boodschapper-RNA, en het laatste wordt vertaald in de taal van aminozuren, de bouwstenen van eiwitten.

Wat is een recombinant DNA?

Tussen de jaren zeventig en tachtig begonnen moleculair biologen te profiteren van de processen die van nature in de cel plaatsvinden en konden ze deze naar het laboratorium extrapoleren.

Op deze manier kan een gen van dierlijke oorsprong (bijvoorbeeld een gewerveld dier) in een stuk DNA van een bacterie worden ingebracht; of het DNA van een bacterie kan worden gecombineerd met een viraal DNA. We kunnen dus een recombinant DNA definiëren als een molecuul dat bestaat uit DNA van twee verschillende organismen.

Zodra dit hybride of recombinante molecuul is gemaakt, wordt het gen van interesse tot expressie gebracht. Met het woord expressie willen we verwijzen naar het proces van vertaling naar eiwit.

Restrictie-enzymen en ligasen: de sleutel tot het proces

Een sleutelelement bij de ontwikkeling van recombinant-DNA-technologie was de ontdekking van restrictie-enzymen.

Dit zijn eiwitmoleculen die het vermogen vertonen om DNA (nucleasen) in specifieke sequenties te splitsen en als "moleculaire schaar" dienen. De fragmenten die door deze enzymen worden gegenereerd, worden restrictiefragmenten genoemd.

Deze enzymen kunnen symmetrische sneden in de doelsequentie (in beide ketens op dezelfde hoogte) of asymmetrische sneden produceren. Een belangrijk aspect van de werking van restrictie-enzymen is dat na de splitsing van de ketens een "losse rand" wordt verkregen, complementair aan de andere rand die door hetzelfde enzym wordt gesneden.

Enkele voorbeelden zijn ECOR 1 en Sma 1. Momenteel zijn meer dan 200 soorten restrictie-enzymen bekend en commercieel verkrijgbaar.

Om nuttig te zijn, moet een schaar vergezeld gaan van de lijm. Deze afdichtende werking van het DNA (eerder behandeld met restrictie-enzymen) wordt uitgevoerd door ligasen.

Techniek: hoe wordt het DNA van een organisme kunstmatig gewijzigd in het laboratorium?

Hieronder zullen we de belangrijkste stappen beschrijven die de recombinant-DNA-technologie vereist. Alle worden uitgevoerd door professionals in een laboratorium voor moleculaire biologie.

Wat is een "kloon"?

Voordat we verder gaan met het experimentele protocol, moeten we opmerken dat in de moleculaire biologie en biotechnologie de term "kloon" en het werkwoord "kloon" algemeen worden gebruikt. Dit kan tot verwarring leiden.

In deze context bedoelen we niet het klonen van een heel organisme (zoals in het geval van het beroemde Dolly het schaap bijvoorbeeld), maar het klonen van een stukje DNA, dat een gen kan zijn. Dat wil zeggen, veel kopieën produceren - genetisch identiek - van de reeks.

1. Isolatie en verkrijgen van DNA

De eerste stap is om te beslissen welke reeks u wilt gebruiken. Dit hangt volledig af van de onderzoeker en de doelstellingen van zijn werk. Dit DNA moet vervolgens worden geïsoleerd en gezuiverd. De methoden en procedures om dit te bereiken zijn op hun beurt afhankelijk van het lichaam en het weefsel.

Over het algemeen wordt een stukje weefsel afgenomen en in een lysisbuffer met proteïnase K (een proteolytisch enzym) behandeld en vervolgens wordt het DNA geëxtraheerd. Vervolgens wordt het genetisch materiaal gefragmenteerd in kleine fragmenten.

2. Kloneringsvector

Na de voorbereidende stappen probeert de onderzoeker het van belang zijnde DNA-segment in een kloneringsvector te introduceren. Vanaf nu zullen we dit segment van DNA wit DNA noemen.

Plasmiden

Een van de meest gebruikte vectoren in een plasmide van bacteriële oorsprong. Een plasmide is een dubbelstrengs, circulair DNA-molecuul dat van nature in bacteriën voorkomt. Ze zijn vreemd voor het bacteriële chromosoom - dat wil zeggen, ze zijn extrachromosomaal en komen van nature voor in deze prokaryoten.

De basiselementen van een vector zijn: (a) een oorsprong van replicatie, die DNA-synthese mogelijk maakt; (b) selectiemiddel, dat het mogelijk maakt om de organismen te identificeren die het plasmide met het doel-DNA dragen, zoals resistentie tegen een of ander antibioticum; en (c) multikloneringsplaats, waar de sequenties worden gevonden die door de restrictie-enzymen zullen worden herkend.

Het eerste succesvolle recombinant-DNA in het laboratorium werd gekloond in het plasmide pSC101 van de bacterie E. coli. Deze bevat een restrictieplaats voor het restrictie-enzym EcoRI en een gen voor resistentie tegen een antibioticum, naast de oorsprong van replicatie.

De insertie van het doel-DNA in het plasmide wordt uitgevoerd met behulp van de moleculaire hulpmiddelen van restrictie-enzymen en ligasen die in de vorige sectie zijn beschreven.

Resterende vectortypes

Naast plasmiden kan DNA worden ingevoegd in andere vector, zoals bacteriofaag lambda, cosmiden, YAC's (kunstmatige chromosomen van gist), BAC's (kunstmatige bacteriële chromosomen) en faagmiden.

3. Introductie van recombinant DNA

Zodra het recombinante DNA-molecuul (gen van belang in het plasmide of andere vector) is verkregen, wordt het geïntroduceerd in een gastheer of gastheerorganisme, dat een bacterie kan zijn.

Om vreemd DNA in een bacterie te brengen, wordt een techniek gebruikt die bacteriële transformatie wordt genoemd, waarbij het organisme wordt onderworpen aan een behandeling met tweewaardige kationen waardoor het vatbaar wordt voor opname van DNA.

Methodologisch kunnen we niet garanderen dat 100% van de bacteriën in onze cultuur ons recombinant DNA-molecuul effectief heeft opgenomen. Dit is waar het deel van het plasmide dat antibioticaresistentie bevat in het spel komt.

De bacteriën die het plasmide hebben opgenomen, zullen dus resistent zijn tegen een bepaald antibioticum. Om ze te selecteren, is het voldoende om het antibioticum toe te passen en de overlevenden te nemen.

4. "Oogst" het eiwit

Na het selecteren van de bacteriën met ons recombinant DNA, gaan we verder met het gebruik van de enzymatische machinerie van de gastheer om het eiwitproduct van interesse te genereren. Terwijl de bacteriën zich voortplanten, wordt het plasmide doorgegeven aan hun nakomelingen, zodat het tijdens de deling niet verloren gaat.

Deze procedure gebruikt de bacteriën als een soort eiwit "fabriek". Later zullen we zien dat het een zeer relevante procedure is geweest bij de ontwikkeling van effectieve medische behandelingen.

Als de kweek klaar is en de bacteriën grote hoeveelheden eiwit hebben geproduceerd, wordt de cel gelyseerd of verstoord. Er is een breed scala aan biochemische technieken waarmee eiwitten kunnen worden gezuiverd op basis van hun fysisch-chemische kenmerken.

In een andere experimentele context zijn we misschien niet geïnteresseerd in het genereren van het eiwit, maar eerder in het verkrijgen van de DNA-sequentie als zodanig. Als dit het geval was, zou het plasmide worden gebruikt om meerdere kopieën van het fragment van interesse te maken om genoeg van het doel-DNA te hebben om de relevante experimenten uit te voeren.

Toepassingen

Recombinant-DNA-technologie opende een oneindig aantal mogelijkheden op het gebied van moleculaire biologie, biotechnologie, geneeskunde en andere gerelateerde gebieden. De meest opvallende toepassingen zijn de volgende.

Genetische analyse

De eerste toepassing houdt rechtstreeks verband met laboratoria voor moleculaire biologie. Recombinant-DNA-technologie stelt onderzoekers in staat de normale functie van genen te begrijpen, en de gegenereerde eiwitten kunnen worden gebruikt voor verder onderzoek.

Farmaceutische industrie

Eiwitten die zijn geproduceerd met behulp van de recombinant-DNA-procedure, hebben toepassingen in de geneeskunde. Twee zeer relevante voorbeelden op dit gebied zijn humane insuline en groeihormoon, dat wordt toegepast bij patiënten die dit eiwit missen.

Dankzij recombinant DNA kunnen deze eiwitten worden gegenereerd zonder dat ze uit een ander mens hoeven te worden geëxtraheerd, wat bijkomende methodologische complicaties en gezondheidsrisico's met zich meebrengt. Dit heeft bijgedragen aan het verbeteren van de kwaliteit van leven van talloze patiënten.

Referenties

1. Baca, LEL en Álvarez, CLC (2015). Biologie 2. Grupo Redactie Patria.
2. Cooper, GM, Hausman, RE en Hausman, RE (2000). De cel: een moleculaire benadering (Deel 10). Washington, DC: ASM-pers.
3. Devlin, TM (2004). Biochemie: leerboek met klinische toepassingen. Ik draaide me om.
4. Khan, S., Ullah, MW, Siddique, R., Nabi, G., Manan, S., Yousaf, M., & Hou, H. (2016). De rol van recombinant-DNA-technologie om het leven te verbeteren. International journal of genomics, 2016, 2405954.
5. Mindán, FP en Mindan, P. (1996). Pathologische anatomie. Elsevier Spanje.
6. Tortora, GJ, Funke, BR, & Case, CL (2007). Inleiding tot microbiologie. Panamerican Medical Ed.
7. The, MJ (1989). Humane insuline: het eerste medicijn van DNA-technologie. American Journal of Health-System Pharmacy, 46 (11_suppl), S9-S11.