KINYOUN-KLEURING: GRONDGEDACHTE EN TECHNIEKEN - BIOLOGIE - 2025

De Kinyoun-kleuring is een kleuringstechniek die wordt gebruikt om bacteriën en parasieten te kleuren die resistent zijn tegen zure alcohol. Het werd geboren uit de modificatie van de Ziehl-Neelsen-kleuring; Beide technieken worden op dezelfde manier geïnterpreteerd, maar verschillen in twee elementen: bij de bereiding van het hoofdreagens en doordat de Kinyoun-techniek geen warmte gebruikt.

Om deze reden wordt het ook wel koud gemodificeerde Ziehl-Neelsen of Kinyoun koudbeits genoemd. Het is geïndiceerd voor de kleuring van Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium leprae, atypische mycobacteriën, Nocardias sp, Cryptosporidium parvum, Cryptosporidium meleagridis, Cryptosporidium felis, Cryptosporidium muris en Cyclosporas cayetanensis.

Cryptosporidium parvum gekleurd met Kinyoun-kleurstof. Punlop Anusonpornperm, van Wikimedia Commons

Het is vermeldenswaard dat Nocardia's zwak kleuren met deze techniek, omdat ze gedeeltelijk zuur-alcoholbestendig zijn, dus voor dit geslacht is er een wijziging van de methodologie.

Op zijn beurt is de koude Kinyoun-techniek gecombineerd met de trichrome-techniek die door Didier is aangepast voor de detectie van coccidia (Cryptosporidium parvum en Isospora belli) en microsporidiumsporen (Enterocytozoon bieneusi en Encephalitozoon intestinalis).

Basis

Het belangrijkste kleuringsreagens is carbolfuchsine of carbolfuchsine, dat de eigenschap heeft te binden aan carbolzuren die aanwezig zijn in de lipidenrijke wasachtige celwand (mycolzuren) van mycobacteriën en bepaalde parasieten.

Deze binding wordt niet tegengegaan door het zure bleekmiddel; daarom worden micro-organismen gedefinieerd als zuurvast.

In tegenstelling tot de Ziehl-Neelsen-techniek -die de kleurstof door warmte fixeert-, is deze stap bij de Kinyoun-techniek niet nodig, omdat de carbolische fuchsine-oplossing die voor deze techniek is bereid een hoge concentratie fenol bevat.

Fenol lost het lipidemateriaal in de celwand op, waardoor de carbolfuchsinekleurstof kan binnendringen. Nadat de kleurstof is binnengedrongen, blijft deze vast ondanks het wassen met zure alcohol.

Op deze manier krijgen de zuurvaste micro-organismen de karakteristieke rode kleur, terwijl alles wat niet zuurvast is verkleurt en blauw wordt.

Techniek

materialen

- Gemodificeerde carbol fuchsin.

- Alcoholzuur.

- Methyleenblauw.

Bereiding van Kinyoun carbol fuchsine

- Basis fuchsine: 4 gr.

- Fenol: 8 ml.

- Alcohol (95%): 20 ml.

- Gedestilleerd water: 100 ml.

De basisfuchsine moet langzaam in de alcohol worden opgelost en voortdurend worden gemengd. Vervolgens wordt het gekristalliseerde fenol gesmolten in een waterbad van 56 ° C. Eenmaal opgelost, wordt 8 ml toegevoegd aan de hierboven bereide fuchsine-oplossing.

Bereiding van de zuur-alcohol

- Geconcentreerd zoutzuur: 3 ml.

- Ethanol (95%): 97 ml.

Het moet worden gemeten, samengevoegd en gemengd.

Bereiding van de contrastkleurstof methyleenblauw

- Methyleenblauw: 0,3 g.

- Gedestilleerd water: 100 ml.

Het wordt gewogen en opgelost.

Kinyoun-kleurtechniek

1- Maak een uitstrijkje rechtstreeks van het monster, dat onder andere kan bestaan ​​uit sputum, longvloeistof, urinesediment, cerebrospinale vloeistof of ontlasting; of uit een suspensie van micro-organismen die zijn verkregen uit zuivere kolonies die zijn ontwikkeld in primaire kweekmedia.

2- Fixeer het uitstrijkje met warmte.

3- Plaats het uitstrijkje op de kleuringsbrug en bedek met het voorbereide Kinyoun carbol fuchsine-reagens. Laat het 3 tot 5 minuten rusten.

4- Was met gedestilleerd water.

5- Bleekmiddel met zure alcohol gedurende 3 minuten en was opnieuw met gedestilleerd water.

6- Bleken opnieuw met zure alcohol gedurende 1 of 2 minuten totdat er geen kleur meer weggaat.

7- Was met gedestilleerd water en laat uitlekken, waarbij u de glijbaan verticaal plaatst.

8- Bedek het preparaat met methyleenblauw en laat 4 minuten inwerken.

9- Was met gedestilleerd water en laat aan de lucht drogen.

10- Onderzoek op 40X en vervolgens op 100X.

Om de kleuring van zuurvaste micro-organismen te verbeteren en te versnellen, voegt u 1 druppel van een bevochtigingsmiddel (zoals Tergitol nr. 7) toe aan 30 tot 40 ml Kinyoun Carbol Fuchsin.

Sommige laboratoria veranderen de methyleenblauwe contrastkleurstof in heldergroen of picrinezuur; de eerste geeft een groene kleur aan de achtergrond en de tweede geeft een gele kleur.

Speciale Kinyoun-techniek voor nocardia's

Om de kleuring van bacteriën van het geslacht Nocardia te verbeteren, wordt een modificatie van de Kinyoun-kleuring gebruikt. De techniek is als volgt:

1- Bedek het uitstrijkje met Kinyoun carbol fuchsin gedurende 3 minuten.

2- Wassen met gedestilleerd water.

3- Verkleur kort met zure alcohol bereid op 3% tot er geen kleur meer verdwijnt.

4- Was opnieuw met gedestilleerd water.

5- Bedek het preparaat met methyleenblauw en laat het 30 seconden inwerken.

6- Was met gedestilleerd water en laat aan de lucht drogen.

Gecombineerde carbol fuchsin en trichrome techniek aangepast door Didier

Deze techniek wordt aanbevolen voor de analyse van ontlastingsmonsters op coccidia- en Microsporidium-sporen tegelijkertijd. De te volgen procedure is als volgt:

1- Bedek het uitstrijkje 10 minuten met Kinyoun carbol fuchsin.

2- Verwijder de kleurstof en was met gedestilleerd water.

3- Bleek gedurende 30 seconden met zoutzuuralcohol.

4- Was opnieuw met gedestilleerd water.

5- Bedek het uitstrijkje met een trichroomoplossing gedurende 30 minuten bij 37 ° C.

6- Wassen met gedestilleerd water.

7- Bleek gedurende 10 seconden met azijnzuuralcohol.

8- Was het uitstrijkje gedurende 30 seconden met 95% ethanol.

QA

Als positieve controle worden uitstrijkjes bereid met Mycobacterium tuberculosis-stammen en gekleurd met de voorbereide reagentia om te verifiëren dat de bacteriën de juiste kleur aannemen (rood-fuchsia).

Negatieve controles kunnen ook worden gebruikt door uitstrijkjes te maken met een andere soort dan zuuralcoholvast, waardoor wordt gecontroleerd of het hele monster de contrasterende kleur aanneemt.

Kinyoun-techniek vergeleken met de Ziehl-Neelsen-techniek

De Kinyoun-techniek is eenvoudiger omdat het de verwarmingsstap overbodig maakt, maar het belangrijkste voordeel is dat het de uitstoot van zeer giftige en kankerverwekkende dampen op lange termijn vermijdt. Daarom is de Kinyoun-kleurstof veiliger voor kleurpersoneel.

Het is belangrijk om er rekening mee te houden dat ervoor moet worden gezorgd dat de reagentia niet in direct contact komen met de huid, aangezien ze corrosief zijn en het bleekmiddel ontvlambaar is.

Wat de nadelen betreft, een negatief uitstrijkje betekent niet noodzakelijk dat het organisme niet aanwezig is. Bovendien kan de aanwezigheid van celresten leiden tot valse positieven, wat leidt tot verwarring bij de diagnose.

Referentie

1. Toegepaste klinische chemie. (2016). BK Kinyoun Kit Beschikbaar op: cromakit.es
2. Orozco-Rico Miguel. Kinyoun-vlek en twee Coccidia bij HIV. Medisch tijdschrift MD. 2011; 3 (2): 137
3. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A (2009). Bailey & Scott Microbiologische diagnose. 12 ed. Argentinië. Redactioneel Panamericana SA
4. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Microbiologische diagnose. (5e ed.). Argentinië, Redactie Panamericana SA
5. Wikipedia-bijdragers. "Kinyoun-vlek." Wikipedia, de gratis encyclopedie. Wikipedia, The Free Encyclopedia, 8 februari 2018. Web. 5 januari 2019.
6. Combol A, Fernández N, Figueredo E, Acuña A, Zanetta E. Implementatie van een kleurtechniek voor de gelijktijdige diagnose van Coccidia en Microsporidia. Instituut voor Hygiëne van de Universiteit van de Republiek. Montevideo. Uruguay. Beschikbaar op: hygiene.edu.uy