HEMATOXYLINE-EOSINE-KLEURING: KENMERKEN, TOEPASSINGEN, TECHNIEKEN - CHEMIE - 2025

De hematoxyline - eosine is een kleuringstechniek waarbij de combinatie van de kleurstoffen hematoxyline en eosine wordt gebruikt. Dit paar kleurstoffen vormt een perfect duo, omdat hematoxyline fungeert als een basische kleurstof en eosine een zure kleurstof is.

De aanduiding van basische of zure kleurstoffen verwijst niet naar de pH die ze in oplossing verkrijgen, maar spreekt eerder over de heersende verhouding in termen van de anionische of kationische ladingen die ze bezitten of de locatie van de chromofoorgroep.

Hematoxyline - eosine (HE) gekleurd trilharen zuilvormig epitheel Bron: Todd Straus en Vladimir Osipov

In die zin wordt hematoxyline beschouwd als een basische (kationische) kleurstof en heeft daarom affiniteit voor zure structuren, zoals de celkern. Terwijl eosine, een zure (anionische) kleurstof, affiniteit heeft voor alkalische of basische structuren, zoals celcytoplasma.

Om deze reden wordt deze combinatie van kleurstoffen veel gebruikt voor weefselkleuring, omdat hierdoor kernen en cytoplasma's duidelijk kunnen worden onderscheiden. De kernen kleuren donkerblauw of paars en het cytoplasma roze.

Hematoxyline-eosine-kleuring is een van de meest gebruikte kleurtechnieken op het gebied van histologie en cytologie, vanwege de eenvoudige bediening en lage kosten. Het wordt gebruikt om cellen, dikke zenuwvezels en de aanwezigheid van bepaalde micro-organismen in weefsels in beeld te brengen, zoals: parasieten, schimmels en bacteriën.

kenmerken

Hematoxyline

Hematoxyline is een neutrale kleurstof. De component die de kleur levert (chromofoor) bevindt zich echter in het kationische of basische centrum van het molecuul. Vandaar zijn affiniteit voor zure structuren. De chemische formule is C ₁₆ H ₁₄ O ₆ en de wetenschappelijke naam is 7,11b-dihydroindenochromeen-3, 4,6a, 9,10 (6 H) -pentol.

Het kleurt voornamelijk de kernen van cellen, omdat ze erg rijk zijn aan nucleïnezuren. Het kan ook cytoplasmatische insluitsels van virale oorsprong verkleuren.

Om hematoxyline te laten kleuren, moet het in een geoxideerde toestand zijn en aan een metaal gebonden. De laatste zal dienen om zich aan het weefsel te fixeren, dat wil zeggen, het zal als bijtmiddel werken.

Wanneer hematoxyline wordt geoxideerd, wordt het hemateïne genoemd. Oxidatie wordt bereikt door blootstelling aan zuurstof (veroudering) van het reagens of door stoffen die de oxidatie bevorderen (chemische oxidatie).

Eosin

Eosine is een kleurstof die rood of roze kleurt. Het is onoplosbaar in water, hoewel er een in water oplosbare versie is. Over het algemeen wordt eosine bereid door op te lossen in alcohol (95 ° ethanol).

Het kleurt cytoplasma's, spiervezels, cytoplasmatische organellen en collageen, maar kleurt de celkernen niet. Dit komt omdat het negatief geladen is en daarom affiniteit heeft voor positief geladen structuren.

Er zijn twee soorten eosine "Y" en "B". Eosine "Y" staat bekend als gele eosine. De wetenschappelijke naam is tetrabroom fl uoresceïne en de chemische formule is C ₂₀ H ₈ Br ₄ O ₅ .

Aan de andere kant wordt eosine "B" soms blauwachtig erythrosine B genoemd. De wetenschappelijke naam is dibromodynitro fl uoresceïne en de formule is C ₂₀ H ₈ Br ₂ N ₂ O ₉ . Beide lijken erg op elkaar en het verschil tussen het gebruik van de een of de ander is niet echt merkbaar. De meest populaire is echter eosine "Y".

Eosine heeft de eigenschap onderscheid te maken tussen een levende cel en een dode, aangezien het alleen in staat is om het membraan te passeren om zijn cytoplasma te kleuren als de cellen dood zijn, waardoor het cytoplasma van de cel kleurloos blijft als het in leven blijft.

Toepassingen

Zenuwvezelkleuring

Dikke zenuwvezels kunnen worden gekleurd en geïdentificeerd met hematoxyline-eosine. Het is echter niet nuttig voor het kleuren van dunne zenuwvezels, omdat een zilverkleuring nodig is om de laatste zichtbaar te maken.

Histologische vlekken op de huid

Bij het kleuren van de hoornlaag van de huid is de kleurstof die werkt eosine, omdat op dit niveau de cellen geen kern hebben.

In de korrelige laag van de huid kleurt hematoxyline sterk de keratohyalinekorrels in de korrelcellen. Integendeel, de doornuitsteeksellaag van de huid is zwak gekleurd met hematoxyline, terwijl de basale of kiemlaag behoorlijk gekleurd is.

Eosine kleurt het cytoplasma van alle cellen en de intensiteit van de kleur kan van laag tot laag variëren.

Hematoxyline-eosine-kleuring van ontlastingsmonsters

Gómez et al., Toonden in 2005 aan dat kleuring met hematoxyline-eosine effectiever was bij het identificeren van gevallen van amoebiasis als gevolg van Entamoeba histolytica en Entamoeba dispar dan de verse visualisatiemethode (zoutoplossing en lugol) bij patiënten met acute diarree.

Het is ook aangetoond dat het zeer gevoelig is voor het detecteren van erythrofagocytose (amoeben die erytrocyten hebben verzwolgen).

Kleuring van histologische coupes voor de diagnose van infectie

Walwyn et al., In 2004 stelden ze het gebruik van histologische kleurstoffen voor om infectie-veroorzakende micro-organismen op te sporen.

Met behulp van hematoxyline-eosinekleuring waren ze in staat om infecties te visualiseren die werden veroorzaakt door Clostridium, Actinomyces, spirillae of Candida. Ze waren ook in staat om de aanwezigheid van de parasiet Sarcoptes escabiei in huidcoupes en virale insluitsels door cytomegalovirus en herpes in secties van verschillende weefsels waar te nemen.

Technieken

Voor histologische monsters

Histologische sectiekleuring doorloopt een reeks stappen. Het eerste is om de histologische sectie te verkrijgen. Dit moet worden gewaxt om later de sneden (ultrafijn) te verkrijgen met een microtoom. De techniek bestaat uit de volgende stappen:

1-Eliminatie van overtollige paraffine : hiervoor kunt u xylol of Heme-D gebruiken, 3-5 minuten onderdompelen.

2-Rehydratatie van het monster: dit wordt bereikt door het monster onder te dompelen in verschillende concentraties alcoholen (ethanol) in aflopende volgorde (100 °, 90 °, 70 °). In alle gevallen 7 minuten.

3-Verwijdering van overtollige alcohol: hiervoor wordt het 7 minuten ondergedompeld in water.

4-kleuring met hematoxyline: het monster wordt 6-10 minuten ondergedompeld in een bakje met hematoxyline. De belichtingstijd is afhankelijk van de grootte en dikte van het monster.

5-Eliminatie van overtollig hematoxyline: het wordt gedurende 5 minuten met water gewassen en vervolgens wordt een snelle passage (10-20 seconden) door zure alcohol uitgevoerd. Later wordt het weer 5 minuten met water gewassen. Daarna wordt het gedurende 1 minuut ondergedompeld in ethanol bij 96 °.

6-kleuring met eosine: hiervoor wordt het monster gedurende 5 minuten ondergedompeld in de eosinebak.

7-Uitdroging van het monster : om dit te doen, gaat het door de alcoholbakjes (ethanol), maar dit keer in oplopende volgorde. (70 °, 90 °, 100 °). (Voor respectievelijk 5 seconden, 5 seconden, 1 minuut).

8-Verduidelijking van het monster : hiervoor wordt het 5-10 minuten blootgesteld aan xylol en gedroogd om permanent te verzegelen met Canada balsem of ander soortgelijk materiaal.

Voor ontlastingsmonsters op zoek naar

Een uitstrijkje wordt gemaakt op een glaasje met de ontlasting van de patiënt en gedurende 5 minuten gefixeerd met 80% alcohol. Het vel wordt gedurende 5 minuten ondergedompeld in hematoxyline en onmiddellijk gewassen met water.

Vervolgens wordt het snel ondergedompeld in zure alcohol en vervolgens in ammoniakwater. Het wordt gewassen met water. Het wordt 5 minuten gekleurd in eosine. Het monster wordt gedehydrateerd zoals uitgelegd in de stand van de techniek en tenslotte gespoeld met xyleen.

Bereiding van reagentia

- Hematoxyline

Los in een liter gedestilleerd water 50 gram kalium- of ammoniumaluminiumsulfaat op. Voeg als het volledig is opgelost 1 gram gekristalliseerde hematoxyline toe. Bij volledige oplossing wordt 1 g citroenzuur toegevoegd samen met 50 g chloraalhydraat en 0,2 g natriumjodaat.

Het mengsel wordt 5 minuten gekookt, daarna afgekoeld en gefiltreerd om eventuele vaste deeltjes die zijn achtergebleven te verwijderen. Het aldus bereide reagens kan onmiddellijk worden gebruikt.

- Eosin

Het kan worden bereid op basis van alcohol of op waterbasis.

Alcoholische eosine

Los in 100 ml ethanol bij 95 ° 0,5 gram eosine "Y" op. Voeg vervolgens een paar druppels ijsazijn toe.

2% waterige eosine

Los in 1250 ml gedestilleerd water 25 gram in water oplosbare eosine "Y" op. Voeg vervolgens een paar druppels ijsazijn toe.

Zure alcohol

Meet 0,5 ml geconcentreerd zoutzuur af en vul aan tot 100 ml met absolute alcohol.

Ammoniak water

Meet 0,5 ml geconcentreerde ammoniak af en vul aan tot 100 ml met gedestilleerd water.

Referenties

1. Navarrete, G. Histologie van de huid. Rev Fac Med UNAM 2003; 46 (4): 130-133. Beschikbaar op: medigraphic.com
2. Gómez-Rivera N, Molina A, García M, Castillo J, Castillo J, García R, Fonseca I, Valenzuela O.
3. Identificatie van Entamoeba histolytica / E. Dispar door de verse amoebetechniek versus de kleuring met hematoxyline-eosine bij acute diarree. Rev Mex Pediatr 2005; 72 (3); 109-112. Beschikbaar op: medigraphic.com
4. Walwyn V, Iglesias M, Almarales M, Acosta N, Mera A, Cabrejas M.Bruikbaarheid van histologische technieken voor de diagnose van infectie bij anatomische specimens. Rev Cub Med Mil, 2004; 33 (2). Beschikbaar op: scielo.sld
5. PanReac AppliChem ITW-reagentia. Hematoxyline-eosine-kleuring. 2017, Spanje. Beschikbaar op: itwreagents.com
6. Eosin. Wikipedia, de gratis encyclopedie. 7 november 2018, 08:18 UTC. 4 aug.2019, 22:13 en.wikipedia.org
7. "Hematoxyline." Wikipedia, de gratis encyclopedie. 3 mei 2019, 11:23 UTC. 4 augustus 2019, 22:48 wikipedia.org