HISTOCHEMIE: GRONDGEDACHTE, VERWERKING, KLEURING - BIOLOGIE - 2025

Het histochemische is een nuttig hulpmiddel bij de studie van de morfologie van verschillende biologische weefsels (planten en dieren) vanwege het reactieprincipe van weefselcomponenten zoals koolhydraten, lipiden en eiwitten, onder andere chemische kleurstoffen.

Met dit waardevolle hulpmiddel kunnen niet alleen de samenstelling en structuur van weefsels en cellen worden geïdentificeerd, maar ook de verschillende reacties die daarin optreden. Evenzo kan mogelijke weefselschade veroorzaakt door de aanwezigheid van micro-organismen of andere pathologieën worden aangetoond.

Histochemische vlekken. Nijlvirus, Gram-positieve en Gram-negatieve bacteriën (Gram), Histoplasma capsulatum (Grocott), Mycobacterium tuberculosis (Ziehl Neelsen). Bron: Pixinio.com/Wikipedia.org/Nephron / CDC / Dr. George P. Kubica

De histochemie van de afgelopen eeuwen heeft belangrijke bijdragen geleverd, zoals de demonstratie van het bestaan ​​van de bloed-hersenbarrière door Paul Ehrlich. Dit was mogelijk omdat de hersenen van het proefdier dat door Ehrlich werd gebruikt, niet waren gekleurd met aniline, een basiskleurstof.

Dit leidde tot het gebruik van verschillende kleurstoffen, zoals methyleenblauw en indofenol, om de verschillende soorten cellen te kleuren. Deze bevinding leidde tot de classificatie van cellen in acidofiel, basofiel en neutrofiel, volgens hun specifieke kleuring.

Recente studies hebben deze techniek toegepast om de aanwezigheid van verschillende verbindingen, waaronder fenolen, koolhydraten en niet-structurele lipiden, aan te tonen in de weefsels van de Litsea glaucescens-soort, beter bekend als laurier. Deze te vinden, zowel in het blad als in het hout.

Evenzo identificeerden Colares et al, 2016 de plant van medicinale interesse Tarenaya hassleriana, met behulp van histochemische technieken. Bij deze soort werd de aanwezigheid van zetmeel, myrosine, evenals fenolische en lipofiele verbindingen aangetoond.

Basis

Histochemie is gebaseerd op het kleuren van cellulaire structuren of moleculen die in de weefsels aanwezig zijn, dankzij hun affiniteit met specifieke kleurstoffen. De reactie van kleuring van deze structuren of moleculen in hun oorspronkelijke formaat, wordt later gevisualiseerd in de optische microscoop of elektronenmicroscoop.

De specificiteit van de kleuring is te wijten aan de aanwezigheid van ionaccepterende groepen die aanwezig zijn in cellen of weefselmoleculen.

Ten slotte is het doel van histochemische reacties om het door kleuring te kunnen laten zien. Van de grootste biologische structuren tot de kleinste weefsels en cellen. Dit kan worden bereikt dankzij het feit dat de kleurstoffen chemisch reageren met de moleculen van de weefsels, cellen of organellen.

Vervolging

De histochemische reactie kan stappen omvatten voorafgaand aan het uitvoeren van de techniek, zoals fixatie, inbedding en snijden van het weefsel. Daarom moet er rekening mee worden gehouden dat bij deze stappen de te identificeren structuur kan worden beschadigd, wat vals-negatieve resultaten kan opleveren, zelfs als deze aanwezig is.

Desondanks is het van belang dat het weefsel vooraf goed wordt gefixeerd, omdat het autolyse of celvernietiging voorkomt. Hiervoor worden chemische reacties gebruikt met organische oplosmiddelen zoals onder andere formaldehyde of glutaaraldehyde.

De opname van de stof is zo gedaan dat het zijn stevigheid behoudt tijdens het snijden en zo vervorming voorkomt. Ten slotte wordt de snede gemaakt met een microtoom voor de studie van monsters met optische microscopie.

Bovendien wordt aanbevolen om, voordat u verder gaat met de histochemische kleuring, externe of interne positieve controles op te nemen in elke batch tests. Evenals het gebruik van specifieke kleurstoffen voor de te bestuderen structuren.

Histochemische vlekken

Vanaf de opkomst van histochemische technieken tot heden is een breed scala aan kleuringen gebruikt, waaronder de meest gebruikte kleurstoffen zoals: Periodic acid Schiff (PAS), Grocott, Ziehl-Neelsen en Gram.

Evenzo zijn andere kleurstoffen minder vaak gebruikt, zoals onder andere Oost-Indische inkt, orceïne of Masson's trichrome vlek.

Periodic Acid Schiff (PAS)

Met deze kleuring kunnen moleculen met een hoog koolhydraatgehalte worden waargenomen, zoals: glycogeen en mucine. Het is echter ook nuttig voor de identificatie van micro-organismen zoals schimmels en parasieten. Naast bepaalde structuren (basaalmembraan) in de huid en andere weefsels.

De basis voor deze kleuring is dat de kleurstof de koolstofbindingen tussen twee nabijgelegen hydroxylgroepen oxideert. Dit produceert de afgifte van de aldehydegroep, en dit wordt gedetecteerd door het Schiff's-reagens, dat een paarse kleur afgeeft.

Het Schiff's-reagens is samengesteld uit basisch fuchsine, natriummetabisulfiet en zoutzuur, en deze componenten zijn verantwoordelijk voor de paarse verkleuring wanneer aldehydegroepen aanwezig zijn. Anders ontstaat er een kleurloos zuur.

De intensiteit van de kleuring hangt af van de hoeveelheid hydroxylgroepen die in de monosacchariden aanwezig zijn. In schimmels, keldermembranen, mucines en glycogeen kan de kleur bijvoorbeeld variëren van rood tot paars, terwijl de kernen blauw kleuren.

Grocott

Het is een van de vlekken met de hoogste gevoeligheid bij de identificatie van schimmels in in paraffine ingebedde weefsels. Hierdoor kunnen de verschillende schimmelstructuren worden geïdentificeerd: onder andere hyfen, sporen, endosporen. Daarom wordt het beschouwd als een routinekleuring voor de diagnose van mycose.

Het wordt vooral gebruikt bij de diagnose van pulmonale mycosen zoals pneumocystose en aspergillose veroorzaakt door schimmels van respectievelijk de geslachten Pneumocystis en Aspergillus.

Deze oplossing bevat zilvernitraat en chroomzuur, dit laatste is een fixeermiddel en kleurstof. De grondgedachte is dat dit zuur de oxidatie van hydroxylgroepen tot aldehyden veroorzaakt door mucopolyachariden die aanwezig zijn in schimmelstructuren, bijvoorbeeld in de celwand van schimmels.

Ten slotte wordt het in de oplossing aanwezige zilver geoxideerd door de aldehyden, waardoor een zwarte verkleuring ontstaat, de zogenaamde argentafinereactie. Contrastkleurstoffen zoals lichtgroen kunnen ook worden gebruikt en dus zullen de schimmelstructuren in zwart met een lichtgroene achtergrond worden waargenomen.

Ziehl-Neelsen

Deze kleuring is gebaseerd op de aanwezigheid van zuur-alcoholresistentie, geheel of gedeeltelijk, in sommige micro-organismen zoals de geslachten Nocardia, Legionella en Mycobacterium.

Het gebruik van deze vlek wordt aanbevolen, omdat de celwand van de eerder genoemde micro-organismen complexe lipiden bevat die de penetratie van de kleurstoffen belemmeren. Vooral in monsters uit de luchtwegen.

Hierin worden sterke kleurstoffen zoals carbol fuchsin (basische kleurstof) gebruikt en wordt warmte toegepast zodat het micro-organisme de kleurstof kan vasthouden en niet verkleurt met zuren en alcoholen. Ten slotte wordt een methyleenblauw-oplossing aangebracht om de verkleurde structuren te kleuren.

De aanwezigheid van zuur-alcoholbestendigheid wordt waargenomen in roodgekleurde structuren, terwijl structuren die niet bestand zijn tegen vervaging blauw gekleurd zijn.

Gram en Chinese inkt

De Gram is een zeer nuttige vlek bij de diagnose van onder meer bacteriële en schimmelinfecties. Deze kleuring maakt het mogelijk om onderscheid te maken tussen grampositieve en gramnegatieve micro-organismen, wat duidelijk de verschillen laat zien die bestaan ​​in de samenstelling van de celwand.

Terwijl Oost-Indische inkt een vlek is die wordt gebruikt om structuren te contrasteren die polysacchariden (capsule) bevatten. Dit komt doordat er een ring wordt gevormd in de omgeving, wat mogelijk is bij Cryptococcus neoformans.

Orcein

Met deze kleuring worden de elastische vezels en chromosomen van verschillende cellen gekleurd, waardoor het rijpingsproces van de laatste kan worden beoordeeld. Om deze reden is het erg nuttig geweest in cytogenetische onderzoeken.

Dit is gebaseerd op de opname van de kleurstof door de negatieve lading van moleculen zoals DNA, aanwezig in de kernen van een grote verscheidenheid aan cellen. Deze zijn dus blauw tot donkerpaars gekleurd.

Masson's trichroom

Deze vlek wordt gebruikt om enkele micro-organismen of materialen te identificeren die melanische pigmenten bevatten. Dit is het geval bij mycosen, veroorzaakt door dematiaceuze schimmels, pheohifomycosis en bij eumycetoom van de zwarte korrel.

Laatste gedachten

In de afgelopen jaren zijn er veel vorderingen gemaakt bij het creëren van nieuwe diagnostische technieken, waarbij histochemie betrokken is, maar gekoppeld is aan andere grondbeginselen of principes. Deze technieken hebben een ander doel, zoals in het geval van immunohistochemie of enzymohistochemie.

Referenties

1. Acuña U, Elguero J. Histoquímica. An. Chem. 2012; 108 (2): 114-118. Beschikbaar op: are.iqm.csic.es
2. Mestanza R. Frequentie van PAS, Grocott en Ziehl-Neelsen histochemische kleuringen gebruikt voor de identificatie van micro-organismen, uitgevoerd in de Pathologische Anatomische Dienst van het Eugenio Espejo Speciality Hospital in 2015. Centrale Universiteit van Ecuador, Quito; 2016 Beschikbaar op: dspace.uce.edu
3. Tapia-Torres N, de la Paz-Pérez-Olvera C, Román-Guerrero A, Quintanar-Isaías A, García-Márquez E, Cruz-Sosa F.Histochemie, totaal fenolgehalte en antioxiderende activiteit van litsea-blad en hout glaucescens Kunth (Lauraceae). Hout en bossen. 2014; 20 (3): 125-137. Beschikbaar op: redalyc.org
4. Colares, MN, Martínez-Alonso, S, Arambarri, AM. Anatomie en histochemie van Tarenaya hassleriana (Cleomaceae), een soort van medicinale interesse. Latijns-Amerikaans en Caribisch Bulletin van geneeskrachtige en aromatische planten 2016; 15 (3): 182-191. Beschikbaar op: redalyc.org
5. Bonifaz A. Medische basis mycologie. 4e editie. Mexico: redacteurs van McGraw-Hill Interamericana, SA de CV 2012.
6. Silva Diego Filipe Bezerra, Santos Hellen Bandeira de Pontes, León Jorge Esquiche, Gomes Daliana Queiroga de Castro, Alves Pollianna Muniz, Nonaka Cassiano Francisco Weege. Klinisch pathologische en immunohistochemische analyse van plaveiselcelcarcinoom van de spilcel van de tong: een zeldzaam geval. Einstein (São Paulo) 2019; 17 (1): eRC4610. Beschikbaar vanaf: scielo.br