BACTERIEEL UITSTRIJKJE: KENMERKEN EN VOORBEREIDING - BIOLOGIE - 2025

Het bacteriële uitstrijkje is een dunne film uitstrijkje van een suspensie van bacteriële micro-organismen dat wordt gemaakt op een transparante glazen plaat of objectglaasje, voor observatie onder een lichtmicroscoop.

De verlenging in de vorm van een film wordt uitgevoerd om de micro-organismen zoveel mogelijk te scheiden, aangezien de waarneming niet duidelijk is als ze gegroepeerd zijn.

Figuur 1. Bacterieel uitstrijkje gezien onder een scanning elektronenmicroscoop. Bron: pixbay.com

Bij de studie van bacterieculturen worden uitstrijkjesvoorbereiding, fixatie en kleurtechnieken gebruikt om ze beter te analyseren. Vanwege de kleine omvang van micro-organismen is het gebruik van een optische microscoop noodzakelijkerwijs vereist voor hun waarneming.

Optische microscopen zijn essentiële instrumenten voor het observeren van uitstrijkjes. Deze maken gebruik van optische lenzen en licht waardoor de monsters met een sterke vergroting kunnen worden bekeken.

Over het algemeen hebben levende cellen niet voornamelijk gekleurde structuren, gezien met de lichtmicroscoop zijn het kleurloze, transparante monsters, en ze vertonen zeer weinig intern contrast en met hun omgeving.

Waarneming met de eenvoudige lichtveld-lichtmicroscoop, zonder het gebruik van hulpkleuringstechnieken, is zeer beperkt en wordt slechts in enkele gevallen gebruikt, zoals bij het waarnemen van de beweging van micro-organismen.

Voor een optimale waarneming van micro-organismen moet een balans worden gevonden tussen contrast en resolutie. Celdetails zijn niet zichtbaar onder een microscoop, zelfs niet met een hoge resolutie; Het gebruik van kleurstoffen is vereist door middel van kleurtechnieken, die contrast bieden voor observatie.

Kenmerken van een bacterieel uitstrijkje van goede kwaliteit

Uitstekend contrast

Om een ​​uitstekend contrast te bereiken, zijn er geavanceerde microscopen die fasecontrastmicroscopen, differentiële interferentiemicroscopen en donkerveldmicroscopen worden genoemd. Dit type microscoop wordt gebruikt om bacteriële structuren zoals onder meer omhulsels en filamenten te observeren.

Kleuring is een eenvoudige techniek om het contrast te verhogen dat wordt bereikt met een helderveldmicroscoop. Bij deze techniek kunnen verschillende kleuringen worden gebruikt, die de microscopische waarneming aanzienlijk verbeteren.

De vlekken worden rechtstreeks op de uitstrijkjes of verlengstukken van de suspensies van micro-organismen op de objectglaasjes aangebracht, vooraf gedroogd en gefixeerd.

Goede oplossing

Fixatie is een techniek die wordt gebruikt om celstructuren te behouden; veroorzaakt inactivering van micro-organismen en hechting aan het glas van het objectglaasje. Er zijn verschillende fixatiebehandelingen: warmtefixatie en chemische fixatie.

Warmte fixatie

Dit is de meest gebruikte methode om bacteriële uitstrijkjes te observeren. De techniek bestaat erin de bacteriële suspensie van het uitstrijkje door de vlam van een aansteker te leiden. Deze techniek is in staat om de externe morfologie van bacteriën te behouden, maar vernietigt hun interne structuren.

Chemische fixatie

Bij chemische fixatie worden conserveringsmiddelen gebruikt, zoals onder andere formaldehyde of formaline, ethanol en azijnzuur. Het voordeel van het gebruik van chemische fixatiemiddelen is dat het behoud van de interne celstructuren van de micro-organismen wordt bereikt.

Figuur 2. Bloeduitstrijkje. Bron: Bobjgalindo, van Wikimedia Commons

Goede kleuring

De meest gebruikelijke procedures voor het kleuren van een eerder gedroogd en gefixeerd uitstrijkje zijn positieve of eenvoudige kleuring, differentiële kleuring en negatieve kleuring. Er zijn ook speciale technieken voor het kleuren van bepaalde celstructuren (capsule, sporen, flagella).

Positieve kleuring of eenvoudige kleuring

Positieve of eenvoudige kleuring is de meest gebruikte vlekkleuringstechniek. Het gebruikt kleurstoffen die zich kunnen binden aan bepaalde microbiële structuren, waardoor ze onder een microscoop kunnen worden waargenomen.

Deze kleurstoffen hebben chromofoorgroepen (gekleurd gedeelte) in hun chemische structuur, met afwisselende dubbele bindingen en enkele bindingen (conjugatie). Deze bindingen kunnen op hun beurt ionische of covalente bindingen tot stand brengen met sommige cellulaire structuren.

De kleurstoffen die bij positieve of eenvoudige kleuring worden gebruikt, zijn meestal chemische derivaten van aniline (gekleurde organische zouten).

Aan de andere kant kunnen we onder de kleurstoffen sommige vinden met een basische pH en andere met een zure pH.

Basiskleurstoffen

In basiskleurstoffen heeft de chromofoorgroep een positieve elektrische lading. De overgrote meerderheid van prokaryote micro-organismen heeft een neutrale interne pH en hun celoppervlak is negatief geladen. Door deze elektrostatische interactie bindt de chromofoor zich aan de cel en kleurt deze.

Voorbeelden van basische kleurstoffen zijn onder andere methyleenblauw, kristalviolet, malachietgroen, basisch fuscin, safranine.

Zure kleurstoffen

In zure kleurstoffen heeft de chromofoorgroep een negatieve elektrische lading. Deze worden gebruikt om eiwitten te kleuren met positief geladen aminogroepen. Voorbeelden van zure kleurstoffen zijn acid fuscin, rose Bengal, Congo rood en eosine.

Differentiële kleuring

De differentiële kleuringstechniek bestaat uit het aanbrengen van twee kleurstoffen van verschillende kleur of intensiteit, om verschillende micro-organismen onder de microscoop te onderscheiden. De Gramkleuring en de zuur-alcoholbestendige kleuring zijn de meest gebruikte differentiële kleuringen in de bacteriologie.

De Gramkleuring wordt gebruikt als een voorlopige test om de vorm, grootte, celgroepering en het type celwand te kennen. Met behulp van de Gramkleuringstest worden celwandbacteriën ingedeeld in Grampositieve bacteriën en Gramnegatieve bacteriën.

Negatieve kleuring

Bij deze techniek worden chemische kleurstoffen gebruikt die niet het inwendige van de cel binnendringen, maar het medium waarin de micro-organismen zich bevinden als zwarte achtergrond laten verschijnen.

Bij de negatieve kleuringstechniek wordt het uitstrijkje gemaakt met een druppel Oost-Indische inkt of nigrosinesuspensie, die na drogen bij kamertemperatuur een ondoorzichtige film vormt voor de doorgang van licht. Op deze manier verschijnen micro-organismen als heldere vormen op een donkere achtergrond.

Voorbereiding

A. uitstrijkje

1.- Was de dia's goed, droog ze met absorberend papier en label ze. Op het etiket moet de inhoud van het preparaat staan, de datum en de naam van de persoon die het heeft verwerkt.

2.- Steek de aansteker aan en steriliseer de inentingslus in de vlam tot hij helderrood is.

3.- Laat het handvat afkoelen.

4.- Neem de bacteriekweekbuis, verwijder de dop en ga snel langs de opening van de buis nabij de brandervlam (vlam).

5.- Steek de inoculatielus in de buis met de bacteriecultuur en neem het monster.

6.- Als de cultuur in vloeibaar medium is, plaats het monster dat met het handvat is genomen in het midden van het objectglaasje en verdeel het voorzichtig in een cirkel met een diameter van ongeveer 2 cm.

7.- Steriliseer de inoculatielus opnieuw.

8.- Laat het uitstrijkje aan de lucht drogen.

9.- Herhaal stap 3 t / m 8 driemaal.

10.- Als de cultuur in vast medium is, moet vooraf een druppel gedestilleerd water op het objectglaasje worden geplaatst. Dit wordt gedaan om een ​​klein monster van de genomen kweek met de inoculatielus te mengen, zoals aangegeven in stap 2 tot 5 (aseptische omstandigheden).

11.- Verspreid het verdunde monster met de druppel water op het glaasje en herhaal dit driemaal.

B. Fixatie

1.- Voeg twee druppels methanol of absolute ethanol toe aan de droge uitstrijkjes -van culturen in vloeibaar medium-.

2.- Laat de lucht uit de buurt van de aansteker drogen.

3.- Als het uitstrijkje afkomstig is van een kweek op vast medium, wordt het droge uitstrijkje met warmte gefixeerd, waarbij het 2 tot 3 keer snel door het heetste deel van de aansteker wordt geleid.

4.- Raak het onderste deel van het uitstrijkje aan met het dorsale deel van de linkerhand (voor rechtshandigen; gebruik anders de rechterhand) en controleer of het koud is.

C. Eenvoudige kleuring

1.- Voeg 2 druppels van de geselecteerde vlek toe aan het uitstrijkje en laat het inwerken gedurende de tijd die vereist is in de specifieke protocollen voor elke vlek (doorgaans tussen 1 en 5 minuten).

2.- Sommige vlekken vereisen het gebruik van warmte om ze te activeren. In dat geval moet men zeer voorzichtig zijn bij het verwarmen van het objectglaasje in de lichtere vlam (manipuleer het met een pincet en voorkom koken). Oververhitting van het uitstrijkje kan de te observeren cellen vernietigen.

3.- Verwijder overtollige kleurstof door te wassen met gedestilleerd water uit een picette. Verwijder het waswater door voorzichtig met de glijbaan op de rand te tikken, gekanteld op de werktafel.

4.- Laat drogen aan de lucht.

5.- Afhankelijk van het type waarneming wordt in dit stadium een ​​dekglaasje gebruikt of niet. Het dekglaasje beschermt en behoudt het uitstrijkje. Als in dit stadium een ​​olie-immersie-observatie wordt gemaakt, worden geen dekglaasjes gebruikt, maar kan het uitstrijkje niet worden bewaard.

D. Definitieve conservering van het uitstrijkje

1.- Dompel het uitstrijkje achtereenvolgens gedurende minimaal 5 minuten onder in elk van de hieronder aangegeven oplossingen. Het doel van deze "baden" is om het uitstrijkje volledig te dehydrateren. Elk reagens moet grondig worden afgetapt voordat het uitstrijkje in het volgende bad wordt gebracht.

De volgorde van de dehydratatiebaden is als volgt:

1. Ethanol 70%
2. Ethanol 95%
3. Pure aceton
4. Aceton-xylol 1: 1 mengsel
5. Xylol

Daarna aan de lucht laten drogen.

2.- Monteer het dekglaasje, bij voorkeur 22 × 22 mm, met Canada balsem of een ander afdekmedium.

Referenties

1. Briggs, G. (1965). Oorzakelijke factoren bij microbiologische laboratoriumongevallen en infecties. Biologische laboratoria van het Amerikaanse leger. Fort Detrick.
2. Cappucino, JG en Welch, CT (2017). Microbiologie: een laboratoriumhandleiding. Pearson.
3. Holt, JG-redacteur. (1977). De kortere Bergey's Manual of Determinative Bacteriology. 8 ^ste Baltimore: The Williams and Wilkins Co.
4. Johnson, TR en Case; CL (2018). Laboratoriumexperimenten in de microbiologie. Pearson.
5. Tille, P. (2017). Diagnostische microbiologie. 14 ^th St. Louis, Verenigde Staten: Elsiever, Inc.