CYTOCHEMIE: GESCHIEDENIS, STUDIEOBJECT, BRUIKBAARHEID EN TECHNIEKEN - BIOLOGIE - 2025

De cytochemie omvat een reeks technieken die berusten op de identificatie en verwijdering van specifieke stoffen in de cel. Het wordt beschouwd als een tak van celbiologie die celmorfologie combineert met chemische structuur.

Volgens Bensley, grondlegger van de toepassing van moderne cytologie, drukt hij uit dat het doel van cytochemie is om de chemische organisatie van cellen te ontdekken om de mysteries van het leven te begrijpen. Evenals het bestuderen van de dynamische veranderingen die optreden tijdens de verschillende functionele fasen.

1: Paget's extramammaire ziekte. (Hematoxyline-Eosin) 2: seniele plaques waargenomen in de hersenschors bij een patiënt met de ziekte van Alzheimer. (Zilverimpregnering) 3: Konijntong, Collageenvezels (blauw). Spiervezels (paarse stroken). (Masson's trichroom). 4: Leverweefsel met vervetting. (Sudan III) 5: Ontstoken lever. Necrose. (Toluidine-blauw) Bronnen: Wikipedia. com / Gebruiker: KGH / Public Domain-bestanden / Mohit Lalwani

Op deze manier is het mogelijk om de metabolische rol van deze stoffen in de cel te bepalen.

Cytochemie gebruikt twee hoofdmethoden. De eerste is gebaseerd op chemische en fysische procedures. Deze technieken maken gebruik van de microscoop als een onmisbaar instrument om de chemische reacties die plaatsvinden op specifieke stoffen in de cel zichtbaar te maken.

Voorbeeld: het gebruik van cytochemische kleurstoffen, zoals onder andere de Feulgen-reactie of PAS-reactie.

De tweede methode is gebaseerd op biochemie en microchemie. Met deze methodologie is het mogelijk om de aanwezigheid van intracellulaire chemicaliën kwantitatief te bepalen.

Onder de stoffen die in een weefsel- of celstructuur kunnen worden onthuld, zijn de volgende: eiwitten, nucleïnezuren, polysacchariden en lipiden.

Geschiedenis van cytochemie

Cytochemische technieken hebben sinds hun uitvinding geholpen om de samenstelling van cellen te begrijpen, en in de loop van de tijd is er een verscheidenheid aan technieken ontstaan ​​die verschillende soorten kleurstoffen gebruiken met ongelijke affiniteiten en basisprincipes.

Vervolgens opende cytochemie nieuwe horizonten met het gebruik van bepaalde substraten om colorimetrisch de aanwezigheid van enzymen of andere moleculen in de cel aan te tonen.

Evenzo zijn er andere technieken naar voren gekomen, zoals immunocytochemie die een grote hulp is geweest bij de diagnose van vele ziekten. Immunocytochemie is gebaseerd op antigeen-antilichaamreacties.

Aan de andere kant heeft cytochemie ook fluorescerende stoffen gebruikt die fluorochromen worden genoemd, die uitstekende markers zijn voor de detectie van bepaalde celstructuren. Vanwege de kenmerken van fluorochroom benadrukt het de structuren waaraan het is bevestigd.

Wat studeer jij?

De verschillende cytochemische technieken die op een biologisch monster worden gebruikt, hebben iets gemeen: ze onthullen de aanwezigheid van een specifiek type stof en kennen de locatie ervan binnen de biologische structuur die wordt beoordeeld, of het nu een celtype of een weefsel is.

Deze stoffen kunnen enzymen, zware metalen, lipiden, glycogeen en gedefinieerde chemische groepen zijn (aldehyden, tyrosine, enz.).

De informatie die deze technieken opleveren, kan niet alleen een leidraad zijn voor de identificatie van cellen, maar ook voor de diagnose van verschillende pathologieën.

Cytochemische kleuringen zijn bijvoorbeeld erg nuttig om onderscheid te maken tussen de verschillende soorten leukemie, aangezien sommige cellen bepaalde enzymen of sleutelsubstanties tot expressie brengen en andere niet.

Aan de andere kant moet worden opgemerkt dat om het gebruik van cytochemie mogelijk te maken, de volgende overwegingen in acht moeten worden genomen:

1) De stof moet worden geïmmobiliseerd op de plaats waar deze van nature wordt aangetroffen.

2) De stof moet worden geïdentificeerd met behulp van substraten die er specifiek mee reageren en niet met andere verbindingen.

Nut

De monsters die kunnen worden bestudeerd door middel van cytochemische technieken zijn:

- Uitgebreid perifeer bloed.

- Uitgebreid beenmerg.

- Weefsels gefixeerd voor histochemische technieken.

- Cellen gefixeerd door cytocentrifugatie.

Cytochemische technieken zijn zeer ondersteunend op het gebied van hematologie, aangezien ze veel worden gebruikt om te helpen bij de diagnose en differentiatie van bepaalde soorten leukemie.

Bijvoorbeeld: Esterasereacties worden gebruikt om myelomonocytische leukemie te onderscheiden van acute monocytische leukemie.

De uitstrijkjes van beenmerg en perifeer bloed van deze patiënten zijn vergelijkbaar, aangezien sommige cellen alleen morfologisch moeilijk te identificeren zijn. Hiervoor wordt de esterase-test uitgevoerd.

In het eerste geval zijn specifieke esterasen positief, terwijl in het tweede niet-specifieke esterasen positief zijn.

Ze zijn ook erg nuttig in de histologie, omdat bijvoorbeeld het gebruik van de kleurtechniek van zware metalen (zilverimpregnering) de reticulaire vezels van een intense bruine kleur in het myocardweefsel kleurt.

Technieken in cytochemie

Hieronder worden de meest gebruikte technieken toegelicht:

- Gebruik van kleurstoffen

De gebruikte kleurstoffen zijn zeer divers in cytochemische technieken en deze kunnen worden geclassificeerd volgens verschillende gezichtspunten:

Volgens de radicaal waar ze affiniteit mee hebben

Ze zijn onderverdeeld in: zuur, basisch of neutraal. Ze zijn de eenvoudigste en meest gebruikte in de geschiedenis, waardoor we de basofiele componenten van de acidofiele componenten kunnen onderscheiden. Voorbeeld: kleuring met hematoxyline-eosine.

In dit geval kleuren de celkernen blauw (ze nemen hematoxyline, wat de basiskleuring is) en de cytoplasma's, rood (ze nemen eosine, wat de zuurkleuring is).

Volgens de kleur die ze bieden

Ze kunnen orthochromatisch of metachromatisch zijn. De orthochromatica zijn die die de structuren van dezelfde kleur kleuren als de kleurstof. Bijvoorbeeld het geval van eosine, waarvan de kleur rood is en rood kleurt.

Aan de andere kant kleuren metachromaten structuren met een andere kleur dan die van hen, zoals bijvoorbeeld toluïdine, waarvan de kleur blauw is en toch violet kleurt.

Vitale of supravitale kleurstoffen

Het zijn onschadelijke kleurstoffen, dat wil zeggen dat ze cellen kleuren en in leven blijven. Deze vlekken worden vitaal genoemd (bv. Trypanblauw om macrofagen te kleuren) of supravitaal (bv. Janusgroen om mitochondriën te kleuren of neutraal rood om lysosomen te kleuren).

- Detectie van lipiden door middel van in vet oplosbare kleurstoffen

Osmiumtetroxide

Het kleurt lipiden (onverzadigde vetzuren) zwart. Deze reactie kan worden waargenomen met de lichtmicroscoop, maar omdat deze kleurstof een hoge dichtheid heeft, kan deze ook worden gevisualiseerd met een elektronenmicroscoop.

Soedan III

Het is een van de meest gebruikte. Deze kleurstof diffundeert en lost op in de weefsels en hoopt zich op in de lipidedruppeltjes. De kleur is scharlakenrood.

Sudan zwarte vlek B

Het geeft een beter contrast dan de vorige omdat het ook kan oplossen in fosfolipiden en cholesterol. Het is nuttig voor het detecteren van azurofiele en specifieke korrels van volwassen granulocyten en hun voorlopers. Daarom identificeert het myeloïde leukemieën.

- Aldehydegroepkleuring (perjoodzuur Schiff-kleuring)

Periodiekzuur Schiff-kleuring kan drie soorten aldehydegroepen detecteren. Zij zijn:

- Vrije aldehyden, van nature aanwezig in weefsels (plasmareactie).

- Aldehyden geproduceerd door selectieve oxidatie (PAS-reactie).

- Aldehyden gegenereerd door selectieve hydrolyse (Feulgen-reactie).

PAS-reactie

Deze kleuring is gebaseerd op het detecteren van bepaalde soorten koolhydraten, zoals glycogeen. Periodiekzuur Schiff verbreekt de CC-bindingen van koolhydraten als gevolg van de oxidatie van glycolgroepen 1-2, waardoor aldehydegroepen vrijkomen.

Vrije aldehydegroepen reageren met het Schiff's-reagens en vormen een paarsrode verbinding. Het verschijnen van de paarsrode kleur laat een positieve reactie zien.

Deze test is positief in plantencellen en detecteert zetmeel, cellulose, hemicellulose en peptines. Terwijl het in dierlijke cellen mucines, mucoproteïnen, hyaluronzuur en chitine detecteert.

Bovendien is het nuttig bij de diagnose van lymfoblastische leukemieën of erythroleukemie, naast andere pathologieën van het myelodysplastische type.

In het geval van zure koolhydraten kan de alcian blue-kleurstof worden gebruikt. De test is positief als een lichtblauw / turkooizen kleur wordt waargenomen.

Plasmale reactie

De plasmareactie onthult de aanwezigheid van bepaalde alifatische aldehyden met lange ketens, zoals palm- en stearaal. Deze techniek wordt toegepast op bevroren histologische coupes. Het wordt rechtstreeks behandeld met het Schiff-reagens.

Feulgen-reactie

Deze techniek detecteert de aanwezigheid van DNA. De techniek bestaat uit het onderwerpen van het gefixeerde weefsel aan een zwak zure hydrolyse om het later te laten reageren met het Schiff-reagens.

Hydrolyse stelt de deoxyribose-aldehydegroepen bloot aan de deoxyribose-purinebinding. Het Schiff's-reagens reageert dan met de aldehydegroepen die vrij zijn gelaten.

Deze reactie is positief in de kernen en negatief in de cytoplasma's van de cellen. Positiviteit blijkt uit de aanwezigheid van een rode kleur.

Als deze techniek gecombineerd wordt met methylgroen-pyronine, is het mogelijk om tegelijkertijd DNA en RNA te detecteren.

- Cytochemische kleuringen voor eiwitstructuren

Hiervoor kan de Millon-reactie worden gebruikt, die kwiknitraat als reagens gebruikt. Structuren die aromatische aminozuren bevatten, kleuren rood.

- Cytochemische vlekken die substraten gebruiken om de aanwezigheid van enzymen aan te tonen

Deze vlekken zijn gebaseerd op de incubatie van het biologische monster met een specifiek substraat en het reactieproduct reageert vervolgens met diazozouten om een ​​gekleurd complex te vormen.

Esterases

Deze enzymen zijn aanwezig in de lysosomen van sommige bloedcellen en zijn in staat organische esters te hydrolyseren waarbij naftol vrijkomt. De laatste vormt een onoplosbare azokleurstof wanneer deze zich bindt aan een diazozout en kleurt de plaats waar de reactie plaatsvindt.

Er zijn verschillende substraten en afhankelijk van welke wordt gebruikt, kunnen specifieke esterases en niet-specifieke esterases worden geïdentificeerd. De eerste zijn aanwezig in onrijpe cellen van de myeloïde reeks en de laatste in cellen van monocytische oorsprong.

Het substraat dat wordt gebruikt voor de bepaling van specifieke esterasen is: naftol-AS-D chlooracetaat. Terwijl voor de bepaling van niet-specifieke esterasen verschillende substraten kunnen worden gebruikt, zoals naftol AS-D-acetaat, alfa-naftylacetaat en alfa-naftylbutyraat.

In beide gevallen kleuren de cellen dieprood als de reactie positief is.

Myeloperoxidase

Dit enzym wordt aangetroffen in de azurofiele korrels van granulocytcellen en monocyten.

De detectie ervan wordt gebruikt om leukemieën van myeloïde oorsprong te onderscheiden van lymfoïde. Cellen die myeloperoxidasen bevatten, worden okergeel.

Fosfatasen

Deze enzymen maken fosforzuren vrij uit verschillende substraten. Ze verschillen van elkaar volgens de specificiteit van het substraat, de pH en de werking van remmers en inactivatoren.

Een van de bekendste zijn de fosfomonoesterases die eenvoudige esters (PO) hydrolyseren. Voorbeeld: alkalische fosfatase en zure fosfatase, evenals fosfamidasen die de bindingen hydrolyseren (PN). Deze worden gebruikt om lymfoproliferatieve syndromen te differentiëren en voor de diagnose van haarcelleukemie.

- Trichrome kleuringen

Mallary-Azan Trichrome

Ze zijn nuttig om het cytoplasma van cellen te onderscheiden van de vezels van bindweefsel. Cellen kleuren rood en collageenvezels blauw.

Masson's trichroom

Dit heeft hetzelfde nut als het vorige, maar in dit geval kleuren de cellen rood en de collageenvezels groen.

- Kleurstoffen die specifieke organellen kleuren

Janus Green

Het kleurt selectief de mitochondriën.

Zilverzouten en osminezuur

Maakt vlekken op het Golgi-apparaat.

Toluidine blauw

Maakt vlekken op de lichamen van Nissi

Zilverzouten en PAS

Ze kleuren de reticulaire vezels en de basale lamina.

Orceïne en fuchsine-resorcin

Ze verven elastische vezels. Bij de eerste zijn ze bruin geverfd en bij de tweede diepblauw of paars.

- Andere technieken die worden gebruikt in de cytochemie

Gebruik van fluorescerende stoffen of fluorochromen

Er zijn technieken die fluorescerende stoffen gebruiken om de locatie van een structuur in een cel te bestuderen. Deze reacties worden gevisualiseerd met een speciale microscoop genaamd fluorescentie. Voorbeeld: IFI-techniek (indirecte immunofluorescentie).

Detectie van cellulaire componenten door immunocytochemie

Deze technieken zijn erg handig in de geneeskunde omdat ze helpen om een ​​bepaalde celstructuur te detecteren en ook te kwantificeren. Deze reactie is gebaseerd op een antigeen-antilichaamreactie. Bijvoorbeeld: ELISA-technieken (Enzyme Immuno Assay).

aanbevelingen

- Het is noodzakelijk om controle-uitstrijkjes te gebruiken om de goede prestaties van de kleurstoffen te beoordelen.

- Er moeten verse uitstrijkjes worden gebruikt om cytochemische kleuring te ondergaan. Indien niet mogelijk, moeten ze worden beschermd tegen licht en bewaard worden bij 4 ° C.

- Er moet voor worden gezorgd dat het gebruikte fixeermiddel de te onderzoeken stof niet negatief beïnvloedt. Met andere woorden, voorkomen moet worden dat het het kan extraheren of remmen.

- De gebruikstijd van de fixeermiddelen moet worden gerespecteerd, aangezien dit in het algemeen slechts enkele seconden mag duren, aangezien het langer blootstellen van het uitstrijkje aan het fixeermiddel sommige enzymen kan beschadigen.

Referenties

1. "Cytochemie." Wikipedia, de gratis encyclopedie. 30 juni 2018, 17:34 UTC. 9 juli 2019, 02:53 Beschikbaar op: wikipedia.org
2. Villarroel P, de Suárez C.Metaalimpregnatiemethoden voor de studie van myocardiale reticulaire vezels: vergelijkende studie. RFM 2002; 25 (2): 224-230. Beschikbaar op: scielo.org
3. Santana A, Lemes A, Bolaños B, Parra A, Martín M, Molero T. Cytochemie van zure fosfatase: methodologische overwegingen. Rev Diagn Biol.200; 50 (2): 89-92. Beschikbaar op: scielo.org
4. De Robertis E, De Robertis M. (1986). Cellulaire en moleculaire biologie. 11e editie. Redactioneel Ateneo. Buenos Aires, Argentinië.
5. Klassieke hulpmiddelen voor het bestuderen van celbiologie. TP 1 (aanvullend materiaal) - Celbiologie. Beschikbaar op: dbbe.fcen.uba.ar