MALONAATBOUILLON: BASIS, BEREIDING EN GEBRUIK - BIOLOGIE - 2025

De malonaatbouillon is het vloeibare kweekmedium dat wordt gebruikt voor de diagnostische test (malonaat), dat wordt gebruikt om enkele geslachten van de familie Enterobacteriaceae te differentiëren. Het is gemaakt door Leifson in 1933 en later aangepast door Ewing, die een kleine hoeveelheid dextrose en gistextract aan de oorspronkelijke formule heeft toegevoegd.

Het medium bestaat momenteel uit gistextract, ammoniumsulfaat, dikaliumfosfaat, monokaliumfosfaat, natriumchloride, natriummalonaat, dextrose en broomthymolblauw. Deze test is over het algemeen opgenomen in de biochemische identificatiebatterij voor Enterobacteriaceae, en helpt bij het differentiëren van bepaalde geslachten en soorten.

Grafische weergave van de malonaattest. A. Negatieve test, B. (Verzuring) Negatieve test, C. (Gemiddelde alkalisatie) Positieve test. Bron: kleurenbuizen publicdomainpictures.net

De malonaattest is voornamelijk gebaseerd op het vermogen van sommige micro-organismen om natriummalonaat als hun enige koolstofbron en ammoniumsulfaat als hun stikstofbron te gebruiken.

De malonaattest is meestal positief bij sommige soorten van de genera Enterobacter, Klebsiella en Citrobacter. Terwijl de meeste soorten van de geslachten Escherichia, Salmonella, Shigella, Edwardsiella, Yersinia, Serratia, Morganella, Proteus en Providencia, een negatieve reactie geven.

Basis

De malonaattest bestaat uit het aantonen van die bacteriën die natriummalonaat als enige koolstofbron en ammoniumsulfaat als stikstofbron kunnen gebruiken.

De meeste Enterobacteriaceae die geen malonaat gebruiken, kunnen in dit medium groeien en nemen dextrose en gistextract als voedingsstoffen.

In dit geval wordt elke poging om alkalisch te maken door het gebruik van peptonen tegengegaan door de productie van zuren die worden gegenereerd door de fermentatie van dextrose. Evenzo werken dikalium- en monokaliumfosfaten als een buffer, waarbij de pH op 6,7 wordt gehouden.

Dat is de reden waarom, wanneer de test negatief is, de bouillon dezelfde originele kleur (groen) behoudt. In zeldzame gevallen kan het medium zuur worden door fermentatie van dextrose; zonder het gebruik van de peptonen en de pH-indicator zou de kleur van het medium geel worden. Om dit te laten gebeuren, moet de pH dalen tot 6.

Als deze test echter positief is, wordt er gezegd dat het micro-organisme malonaat en ammoniumsulfaat gebruikte als respectievelijk koolstof- en stikstofbronnen, zonder gebruik te maken van de andere componenten.

In dit geval wordt het medium alkalisch door het vrijkomen van natrium en de daaruit voortvloeiende vorming van NaOH. In die zin verandert de pH-indicator (broomthymolblauw) de kleur van het medium van groen naar blauw wanneer de pH gelijk is aan of groter is dan 7,6. Blauw kan licht of intens zijn (Pruisisch blauw).

Ten slotte handhaaft natriumchloride de osmolariteit van het medium en is water het verdunningsmiddel van alle componenten.

Interpretatie

Bouillon met dezelfde kleur (groen) - negatieve test

Gele bouillon: negatieve test

Lichte of diepblauwe bouillon: test positief

Er is een variant genaamd fenylalaninemalonaatbouillon, ook wel het medium van Shaw en Clarke genoemd. In dit geval kunnen twee tests worden geanalyseerd, het gebruik van malonaat als koolstofbron en de productie van pyrodruivenzuur uit fenylalanine.

Voorbereiding

Malonate bouillon

Het aantal gram dat wordt aangegeven op de bijsluiter van het gekozen handelsbedrijf wordt gewogen (dit kan van de ene tot de andere verschillen). De gewogen grammen worden gesuspendeerd in een liter gedestilleerd water. Verwarm een ​​beetje tot het volledig is opgelost. Verdeel 3 ml van het medium in 13/100 reageerbuisjes met katoenen dop.

Steriliseren in autoclaaf bij 121 ° C gedurende 15 tot 20 minuten.

Koel voor gebruik. Als ze niet onmiddellijk worden gebruikt, bewaar ze dan tot gebruik in de koelkast. Breng de bouillon op kamertemperatuur alvorens te inoculeren.

De pH van het medium moet 6,7 ± 0,2 zijn. De kleur van het voorbereide medium is flessengroen.

Phenylalanine Malonate Bouillon

Weeg 11 g van het gedehydrateerde medium af en los op in 1 liter gedestilleerd water. De rest van de voorbereiding is hetzelfde als eerder beschreven.

Het kan ook worden bereid door 2 g / l fenylalanine toe te voegen aan het malonaatbouillonmedium voordat het wordt gesteriliseerd.

Gebruik

Het wordt gebruikt als onderdeel van de reeks biochemische tests die worden samengesteld voor de identificatie van bacteriën van de Enterobacteriaceae-familie.

Helpt onderscheid te maken tussen:

-Het geslacht Klebsiella en Enterobacter (+) van het geslacht Escherichia en Serratia (-).

-De soorten Salmonella enterica ssp arizonae, Salmonella enterica ssp salame en Salmonella enterica ssp diarizonae (+), van de soort Salmonella enterica ssp enterica (-).

-Van het geslacht Klebsiella in het algemeen (+) uit het geslacht Actinobacillus (-).

Af en toe kan het helpen bij de differentiatie van geslachten en bacteriesoorten die niet tot de Enterobacteriaceae-familie behoren, zoals onder de niet-fermenterende Gram-negatieve bacillen Alcaligenes faecalis (+) en Acinetobacter sp (-).

Bron: Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Microbiologische diagnose. 5e druk. Redactioneel Panamericana SA Argentina.

Werkwijze

Onder een aansteker wordt een deel van een pure eau de cologne genomen, met behulp van een goed gesteriliseerd en gekoeld platina handvat. Het genomen monster (licht inoculum) wordt opgelost in de malonaatbouillon. Incubeer met los deksel in aerobiose gedurende 24 tot 48 uur bij 35 ° C ± 0,2.

Malonaatbouillon kan ook worden geïnoculeerd vanuit een kweek van 18-24 uur in trypticase-sojabouillon. In dit geval wordt 0,01 ml ingenomen met een steriele pipet en wordt de malonaatbouillon geïnoculeerd. Incubeer met los deksel in aerobiose gedurende 24 tot 48 uur bij 35 ° C ± 0,2.

Aan het einde van de tijd worden de resultaten geïnterpreteerd. Elk spoor van blauwe kleur na 48 uur incubatie moet als positief worden beschouwd. De test mag pas als negatief worden geïnterpreteerd nadat de incubatietijd van 48 uur is verstreken.

In het geval dat de fenylalaninemalonaatbouillonvariant wordt gebruikt, wordt het malonaat eerst geïnterpreteerd en vervolgens worden 5 druppels 1N HCl en 3-5 druppels 8% ijzerchloride toegevoegd. Een donkergroene kleur wordt geïnterpreteerd als een positieve test voor fenylalanine. Als het medium daarentegen bleekblauw wordt, is de test negatief voor fenylalanine.

QA

Om de steriliteitscontrole van het medium uit te voeren, moeten een of twee bouillons gedurende 24 uur incubatie bij 35 ° C ± 0,2 worden geïncubeerd. Na deze tijd mag er geen troebelheid of kleurverandering optreden.

Voor kwaliteitscontrole kunnen bekende of gecertificeerde stammen worden gebruikt, zoals: Enterobacter aerogenes ATCC 13048, Klebsiella pneumoniae ATCC 33945, Salmonella enterica ssp arizonae ATCC 13314 en Escherichia coli ATCC 25922.

De verwachte resultaten zijn:

• Enterobacter aerogenes, Klebsiella pneumoniae en Salmonella enterica ssp arizonae geven een positieve reactie (middenblauwe kleur).
• Voor Escherichia coli zou het resultaat negatief moeten zijn, dat wil zeggen, er wordt verwacht dat er geen kleurverandering (groen) zal zijn of dat het geel zal worden als gevolg van glucosefermentatie.

Beperkingen

Gebruik geen bouillon die troebelheid, neerslag, kleurverandering of tekenen van bederf vertoont.

Referenties

1. Pedraza J, Sanandres N, Varela Z, Aguirre E, Camacho J. Microbiologische isolatie van Salmonella spp. en moleculaire hulpmiddelen voor de detectie ervan. Uninorte Health. Barranquilla (Col.) 2014; 30 (1): 73-94. Beschikbaar op: scielo.org.co
2. BBL. Malonate Broth, Ewing gemodificeerd. 2007. Beschikbaar op: bd.com
3. Senna Laboratories. Malonato-bouillon. Beschikbaar op: cientificasenna.com
4. RenyLab. Malonato-bouillon. 2013 Beschikbaar op: es.renylab.ind.br
5. Mbiolog Diagnostics. Malonato-bouillon. Beschikbaar op: mbiolog.com
6. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Microbiologische diagnose. 5e druk. Redactioneel Panamericana SA Argentina.
7. Conda Pronadisa Laboratoria. Fenylalaninemalonaatbouillon. Beschikbaar op: condalab.com