MÜELLER HINTON-AGAR: BASIS, BEREIDING EN GEBRUIK - BIOLOGIE - 2026

De Mueller Hinton Agar is niet selectief, het vaste voedingsmedium is samengesteld uit vleesinfusie, peptonzuurcaseïne, zetmeel, agar en gedestilleerd water. Dit medium zorgt voor een uitstekende microbiële groei voor de meeste snelgroeiende bacteriën.

Het is oorspronkelijk gemaakt door John Howard Müeller en Jane Hinton om voedings veeleisende bacteriën zoals Neisseria gonorrhoeae en Neisseria meningitidis te isoleren. Vanwege zijn eigenschappen bleek het echter ideaal te zijn voor het bestuderen van de gevoeligheid voor antibiotica, met betrouwbare en reproduceerbare resultaten.

Antibiogrammen (Müeller Hinton-agar). Bron: Dr Graham Beards op en.wikipedia

Daarom is Müeller Hinton-agar het kweekmedium dat is geaccepteerd door het Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) en het European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing, voor de uitvoering van de antimicrobiële gevoeligheidstest volgens de Kirby-schijfdiffusiemethode en Bauer.

Basis

Omdat het een niet-selectief voedingsmedium is, is het uitstekend geschikt voor de groei van de meeste pathogene bacteriën.

Aan de andere kant zorgt de eenvoudige samenstelling ervoor dat de stoffen er gemakkelijk op diffunderen, wat een essentieel kenmerk is voor de gevoeligheidstest door de schijfdiffusiemethode.

Een ander kenmerk is dat het een lage hoeveelheid remmers bevat, waardoor sulfonamiden, trimethoprim en tetracyclines effectief kunnen worden geëvalueerd.

Houd er echter rekening mee dat het medium aan bepaalde voorwaarden moet voldoen om de goede werking ervan te garanderen, waaronder:

De aanpassing van de pH, de diepte van de agar en de juiste concentratie van thymine, thymidine, Ca ⁺⁺ , Mg ⁺⁺ en Zn ⁺⁺ .

Je moet ook weten dat de methodologie gestandaardiseerd is en dat daarom aan alle parameters moet worden voldaan, zoals:

De concentratie van het inoculum, de concentratie en conservering van de antibioticumschijven, de plaatsing van het juiste aantal schijven op de agar, de afstand tussen de ene schijf en de andere, de strategische plaatsing van bepaalde antibiotica, de atmosfeer, de temperatuur en de tijd van incubatie.

Voorbereiding

Weeg 37 g gedehydrateerd Müeller Hinton-medium af en los op in 1 liter gedestilleerd water. Verhit het medium al roerend om het oplossen te bevorderen. Kook gedurende 1 minuut.

Autoclaaf voor sterilisatie bij 121 ° C gedurende 15 minuten. Bij verwijdering uit de autoclaaf, moet de kolf in een waterbad van 50 ° C worden geplaatst om af te koelen. Giet 25 tot 30 ml in steriele petrischalen met een diameter van 10 cm.

De platen moeten een gemiddelde dikte hebben van 4 mm (ideaal), waarbij een bereik van 3-5 mm is toegestaan.

Als het gewenst is om bloedagar te bereiden met Müeller Hinton-agar als basis, giet dan 5% steriel en gedefibrineerd lamsbloed voordat u het op de borden serveert.

De uiteindelijke pH van het medium moet tussen 7,2 en 7,4 liggen.

Investeer en bewaar in de koelkast tot gebruik. Laat de plaat voor gebruik op kamertemperatuur komen.

De kleur van het voorbereide medium is lichtbeige.

Toepassingen

Het wordt gebruikt om het antibiogram of de gevoeligheidstest voor antibiotica uit te voeren voor de meeste snelgroeiende niet-veeleisende pathogenen.

Als de agar wordt aangevuld met bloed, wordt het gebruikt om het antibiogram uit te voeren van veeleisende micro-organismen zoals: Streptococcus pneumoniae, Haemophilus sp, Neisseria meningitidis, onder anderen. Het is ook gebruikt om Legionella pneumophila te isoleren.

Antibiogram-techniek

Alvorens het antibiogram, een bacteriële oplossing gelijk aan 1,5 x 10 ⁸ cellen moeten worden voorbereid .

Hiervoor worden 3 tot 4 kolonies van de zuivere cultuur genomen en gesuspendeerd in een soja-trypticase-bouillon of in Müeller Hinton-bouillon, 2 tot 6 uur geïncubeerd en de concentratie wordt aangepast met een steriele zoutoplossing, vergeleken met een Mac Farland-standaard van 0,5%.

Als het veeleisende micro-organismen zijn, kunnen kolonies direct worden gesuspendeerd tot een concentratie van 0,5% Mac Farland. Vervolgens wordt de Müeller Hinton-plaat bezaaid met een wattenstaafje dat is geïmpregneerd met de bereide bacteriële oplossing.

Om dit te doen, wordt het wattenstaafje ondergedompeld in de oplossing en vervolgens wordt overtollige vloeistof verwijderd door tegen de wanden van de buis te drukken. Direct daarna wordt het wattenstaafje over het hele oppervlak gehaald, waarbij geen plaatsen onaangeroerd blijven, vervolgens wordt de plaat lichtjes gedraaid en wordt het opnieuw gezaaid. De operatie wordt nog 2 keer herhaald.

Laat 10 minuten staan ​​en plaats dan de antibioticumschijfjes met een steriel pincet, waarbij u een tussenruimte van 24 mm laat. Na het plaatsen van elke schijf op de agar, drukt u lichtjes op elke schijf met de tang om ervoor te zorgen dat ze goed hechten.

Zodra het proces is voltooid, wordt de plaat omgekeerd en 16 tot 18 uur bij 35-37 ° C in aerobiose geïncubeerd. Als het een veeleisend micro-organisme is, kan het micro-aerofilie verdienen en als het antibiogram oxacilline-schijven bevat, moet het na 24 uur worden gelezen.

Een liniaal wordt gebruikt om de diameter van elke halo te meten. De resultaten moeten in mm worden genoteerd. Vervolgens worden de verkregen waarden gecorreleerd met de tabellen met afkappunten gepubliceerd door de huidige CLSI-handleiding.

Meting van de remmingshalo. Bron: USCDCP, Pixnio.com

Rapporteer als gevoelig (S), intermediair (I) of resistent (R), al naargelang het geval.

Antibiotica worden geselecteerd op basis van het geïsoleerde micro-organisme en het type infectie dat het veroorzaakt.

Soms moet de strategische plaatsing van antibiotica in gedachten worden gehouden om fenotypische resistentiepatronen aan het licht te brengen.

Strategische schijfplaatsing op Müeller Hinton-agar

Voor enterobacteriën moet de clavulaanzuurschijf tegen cefalosporines van de 3e en 4e generatie worden geplaatst. Een eivormige verbreding geeft aan dat de stam een ​​producent is van extended-spectrum beta-lactamases (ESBL). Dit betekent dat de patiënt niet met cefalosporines mag worden behandeld.

Fenotypische expressie van productie van beta-lactamase met uitgebreid spectrum (ESBL) in een Escherichia coli-stam. Bron: foto gemaakt door de auteur MSc. Marielsa gil

Bij Staphylococcus is het belangrijk om de erytromycine- of azithromycine-schijf voor de clindamycine-schijf te plaatsen (D-test).

Een resistente halo in erytromycine en een afvlakking in de clindamycine-halo geeft aan dat de stam stam-induceerbare clindamycine-resistentie (ICR) bezit. Dit betekent dat een behandeling met clindamycine niet effectief zal zijn.

Om te zoeken naar induceerbare AMP C-stammen in Enterobacteriaceae en sommige niet-fermenterende Gram-negatieve staafjes, worden tazobactan ceftazidim-, cefoxitine- of piperacilline-schijven geconfronteerd met een imipenemschijf, op een afstand van 27 mm.

Een afgeplatte halo in een van de schijven tegenover imipenem duidt op de aanwezigheid van induceerbare AMP C.

Voor de zoektocht naar constitutief C-AMP wordt een cloxacillineschijf van 500 µg geconfronteerd met ceftazidim (30 µg) en met cefotaxime (30 µg), op een afstand van 25 mm. Een verwijde halo in een van de cefalosporines duidt op positiviteit.

De cloxacillineschijf kan ook worden vervangen door een 9 mm schijf van Whatman nr. 6 filtreerpapier geïmpregneerd met fenylboorzuur (400 µg) met een afstand van 18 mm. Het wordt op dezelfde manier geïnterpreteerd als de vorige.

Tenslotte, om de productie van metallobetalactamases te onderzoeken, vooral in Pseudomonas aeruginosa, wordt een schijf gebruikt die geïmpregneerd is met 10 µl ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA 750 µg) en thioglycolzuur (SMA 300 µg), die wordt geconfronteerd met de imipenem- en meropenemschijven, op een afstand van 15 mm.

De test is positief als de imipenem- of meropenem-halo's verwijden naar de EDTA / SMA-schijf. Dit resultaat moet worden bevestigd door de aangepaste Hodge-test.

Deze methode bestaat uit het inoculeren van een Escherichia coli ATCC 25922-stam op de Müeller Hinton-plaat. Een imipenem-schijf wordt in het midden van de plaat geplaatst en vervolgens wordt een streep gemaakt van de schijf naar de periferie met de vermoedelijke P. aeruginosa-stam. Per plaat kunnen maximaal 4 stammen worden getest.

De test zal positief zijn als er een zone met vervorming van de imipenem-halo rond de striae is.

Oorzaken van foutieve resultaten

- Slecht bewaarde antibioticumschijfjes kunnen valse resistentie veroorzaken. De oxacilline-schijf is bijvoorbeeld erg kwetsbaar voor temperatuurveranderingen.

-Een pH van het medium lager dan aangegeven (zuur) produceert kleinere halo's in aminoglycosiden en macroliden (risico op valse resistentie) en grotere halo's in penicilline, tetracycline en novobiocine (risico op valse gevoeligheid).

-Als de pH hoger is dan aangegeven (alkalisch), worden de hierboven beschreven effecten omgekeerd.

-Media met hoge thymine- en thymidineconcentraties hebben invloed door de remmingshalo's van sulfonamiden en trimethoprim significant te verminderen.

-Hoge concentraties calcium en magnesium veroorzaken valse resistentie van aminoglycosiden, polymyxine B en tetracyclines tegen stammen van Pseudomonas aeruginosa.

-Lage concentraties calcium en magnesium veroorzaken valse gevoeligheden van aminoglycosiden, polymyxine B en tetracyclines tegen stammen van Pseudomonas aeruginosa.

-De aanwezigheid van zink beïnvloedt de resultaten van carbapenemschijven (imipenem, meropenem en ertapenem).

-Dikte van het medium onder 3 mm geeft valse gevoeligheidsresultaten, terwijl dikte boven 5 valse weerstand geeft.

-De mobilisatie van schijven in het antibiogram geeft vervormde halo's, aangezien de afgifte van antibiotica onmiddellijk is.

- Zeer zwakke inoculums beïnvloeden de resultaten, aangezien er geen uniforme of confluente groei in de agar zal zijn, een noodzakelijke voorwaarde om de remmingshalo's te kunnen meten, naast het feit dat de halo's groter kunnen zijn dan normaal.

- Overbelaste inocula kunnen halo's geven die kleiner zijn dan normaal.

-Als de afstand tussen schijven niet wordt gerespecteerd, overlapt de ene halo met de andere en kunnen ze niet correct worden gelezen.

-Incuberen met CO ₂ vergroot de grootte van de halo's van de tetracycline- en methicilline-schijven.

-Incuberen bij temperaturen onder 35 ° C produceert grotere halo's.

-De toevoeging van bloed vermindert de grootte van de sulfa-halo.

Beperking

De gevoeligheid van een antibioticum dat in het antibiogram wordt aangetoond tegen een micro-organisme (in vitro), is geen garantie dat het in vivo zal werken.

QA

Om te weten of het medium de juiste hoeveelheid thymine bevat, moet een stam van Enterococcus faecalis ATCC 29212 worden geplant en moet de gevoeligheid voor trimethoprim sulfamethoxazol (SXT) worden getest, het moet een halo geven gelijk aan of> 20 mm om bevredigend te zijn.

Referenties

1. "Müller-Hinton-agar." Wikipedia, de gratis encyclopedie. 16 nov 2018, 12:23 UTC. 27 januari 2019, 04:22
2. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Bailey & Scott Microbiologische diagnose. 12 ed. Redactioneel Panamericana SA Argentina.
3. Cona E. Voorwaarden voor een goede gevoeligheidsstudie door middel van agar-diffusietest. Rev Chil Infect, 2002; 19 (2): 77-81
4. Laboratorium Difco Francisco Soria Melguizo. Müeller Hinton-agar met 5% schapenbloed. 2009 Beschikbaar op: http://f-soria.es
5. BD Müeller Hinton II Agar-laboratorium. 2017 Beschikbaar op: .bd.com
6. Britannia Laboratories. Müeller Hinton-agar. 2015 Beschikbaar op: britanialab.com
7. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Microbiologische diagnose. 5e druk. Redactioneel Panamericana SA Argentina.
8. Martínez-Rojas D. AmpC-type betalactamases: algemeenheden en methoden voor fenotypische detectie. Rev. Soc. Ven. Microbiol. 2009; 29 (2): 78-83. Beschikbaar op: scielo.org.
9. Perozo A, Castellano M, Ling E, Arraiz N. Fenotypische detectie van metallobetalactamases in klinische isolaten van Pseudomonas aeruginosa. Kasmera, 2012; 40 (2): 113-121. Beschikbaar op: scielo.org.