DNA-SEQUENTIEBEPALING: MAXAM-GILBERT, METHODE EN VOORBEELDEN - BIOLOGIE - 2025

De DNA-sequentiebepaling (deoxyribonucleïnezuur) is een procedure in laboratoria voor moleculaire biologie die het mogelijk maakt om de volgorde van nucleotiden in het genetisch materiaal van belang te kennen. Verder kan de sequentiebepaling van RNA (ribonucleïnezuur) ook worden beschreven.

Deze techniek is onmisbaar geweest voor de ontwikkeling van biologische wetenschappen. Het is ook toepasbaar op andere kennisgebieden, zoals bijvoorbeeld medische diagnostiek en forensisch onderzoek.

Bron: pixabay.com

Eerder werd het sequencen van een DNA-streng als een langzame en dure activiteit beschouwd, waardoor de identificatie van slechts een paar basenparen in de oligonucleotiden mogelijk was.

Tegenwoordig, met alle vooruitgang in de wetenschap, is DNA-sequencing een routinematige operatie in veel laboratoria over de hele wereld dankzij de bijdrage van bijna 50 jaar onderzoek op dit gebied. In termen van ketenlengte kunnen in zeer korte tijd tot miljoenen basenparen worden gesequenced.

Om dit te doen zijn er tientallen technieken ontwikkeld die variëren in prijs en precisie. In dit artikel zullen we zowel klassieke als moderne technieken beschrijven, elk met zijn voor- en nadelen.

Tot nu toe maken sequencing-technieken het mogelijk om de sequentie van complete genomen te verkrijgen, van kleine prokaryoten en gisten tot het menselijk genoom.

DNA-structuur

Om de methoden en technieken die worden gebruikt voor DNA-sequentiebepaling te begrijpen, is het noodzakelijk om bepaalde belangrijke aspecten van de structuur en samenstelling van het molecuul te kennen.

DNA is een biomolecuul dat in alle levende wezens voorkomt, van bacteriën tot grote waterdieren. Organellen - zoals mitochondriën en chloroplasten - hebben een cirkelvormig DNA-molecuul erin. Zelfs bij sommige virussen is het gevonden genetisch materiaal DNA.

Structureel is DNA een verzameling nucleotiden. Elk bestaat uit een koolhydraat, een stikstofbase (A, T, C of G) en een fosfaatgroep. Het doel van DNA-sequencing is om de volgorde te onthullen waarin de vier stikstofbasen in de sequentie worden gevonden.

Geschiedenis

Halverwege de jaren vijftig beschreven onderzoekers Watson en Crick de structuur van DNA met behulp van christolografische technieken. Geen van deze onderzoekers had echter een manier kunnen vinden om de reeks te ontrafelen.

Hoewel er bepaalde voorlopers waren, was de belangrijkste gebeurtenis de creatie van de Sanger-methode in 1977. Frederick Sanger, de vader van de methode, was een Britse biochemicus, winnaar van twee Nobelprijzen voor zijn enorme bijdragen aan de biologische wetenschappen.

Deze techniek is in de literatuur ook bekend als "ketenbeëindiging" of dideoxynucleotiden. De principes van deze techniek en degene die zijn ontwikkeld op basis van verbetering en innovatie, worden hieronder beschreven.

Sanger-methode

De ontwikkeling van de Sanger-methode vertegenwoordigde een cruciale gebeurtenis in de moleculaire biologie. Het omvat de basiscomponenten van het DNA-replicatieproces dat normaal in de cel plaatsvindt, maar voegt een speciale component toe: dideoxynucleotiden.

Hoofdbestanddelen van de reactie

- DNA-polymerase: het DNA-polymerase-enzym is een cruciaal onderdeel van het proces. Dit molecuul neemt deel aan de replicatie van de DNA-streng en zijn rol is de synthese van de nieuwe streng, waarbij de trifosfaatdeoxyribonucleotiden worden gecombineerd met de complementaire.

Bedenk dat in DNA thymines (T) paren met adenines (A) via twee waterstofbindingen, terwijl cytosine (C) dit doet met guanine (G) via drie bindingen.

- Nucleotiden: Sanger-sequencing omvat twee soorten nucleotiden, de vier 2'-deoxynucleotiden (afgekort als dATP, dGTP, dCTP en dTTP) en de vier dideoxynucleotiden (ddATP, ddGTP, ddCTP en ddTTP).

Hoewel dideoxynucleotiden vergelijkbaar zijn met de monomeren die normaal in DNA worden opgenomen, missen ze een -OH-groep in hun structuur. Dit maakt het onmogelijk om een ​​nieuw nucleotide aan de ketting toe te voegen.

Daarom, wanneer een speciaal nucleotide - op een totaal willekeurige manier - wordt toegevoegd aan de keten in vorming, wordt de synthese verlamd. Aan het einde van de reactie zijn er dus ketens van verschillende grootte, elk waarbij de reactie op een ander punt werd gestopt.

Experimenteel worden vier tests voorbereid. Elk bevat het DNA dat is geëxtraheerd uit het biologische monster van interesse, de normale nucleotiden en een van de vier speciale nucleotidetypes. Ofwel de speciale nucleotiden zijn gemarkeerd met een soort fluorescerende marker (zie geautomatiseerde sequencing hieronder).

De resultaten lezen

De eerste stap is om elk van de gesynthetiseerde ketens te scheiden op basis van hun grootte. Sommige zullen langer zijn dan andere, afhankelijk van waar de speciale bases zijn opgenomen.

Er zijn verschillende biochemische technieken die de scheiding van de componenten van een mengsel mogelijk maken met behulp van grootte als onderscheidende eigenschap. In de methode van Sanger worden de verschillende ketens gescheiden door elektroforese. In de meer geavanceerde varianten van de techniek wordt capillaire elektroforese gebruikt.

De langere strengen reizen dus minder dan de kortere varianten. Dit systeem gaat vervolgens door een lezer die de marker herkent die in elk dideoxynucleotide is opgenomen. Op deze manier kan de volgorde van de reeks bekend worden.

Deze "eerste generatie" techniek is in staat om DNA-fragmenten te lezen die niet groter zijn dan 1 kilobase. Momenteel wordt de Sanger-methode in verschillende laboratoria gebruikt, meestal in zijn moderne varianten. Bovendien wordt het gebruikt om de resultaten te bevestigen die zijn verkregen met de meest complexe technieken - maar minder nauwkeurig.

Automatische volgordebepaling

Wanneer sequencing op grote schaal vereist is, wordt het proces versneld door automatisering. Dit is een variatie op de Sanger-ketenbeëindigingsmethode, waarbij de primers worden gelabeld met fluorescerende producten om ze te onderscheiden.

Vervolgens wordt het reactieproduct in een elektroforese geleid - allemaal op een enkele baan. Als elk fragment het laatste deel van de gel verlaat, wordt het snel geïdentificeerd door zijn fluorescerende labeling, met een fout rond 1%.

De meest geavanceerde systemen hebben een systeem van maximaal 96 capillaire buisjes die worden beheerd door een computer die is gekoppeld aan een robot. Dat wil zeggen dat 96 DNA-monsters tegelijkertijd kunnen worden getest. Het proces met elektroforese en analyse van de resultaten is dus volledig geautomatiseerd.

Op één dag kunnen deze systemen tot 550.000 basen sequencen. Tijdens het proces is menselijke arbeid niet nodig, het duurt slechts ongeveer 15 minuten om de methode te starten.

Maxam-Gilbert-sequencing

Op hetzelfde moment dat Sanger zijn werk publiceerde, slaagden twee onderzoekers genaamd Allan Maxan en Walter Gilbert erin een andere methode te ontwikkelen om de DNA-sequentie te verkrijgen. De methode won destijds aan populariteit, maar werd later vervangen door de verbetering van de methode van Sanger.

In tegenstelling tot de Sanger-methode, omvat de sequentiebepaling van Maxan en Gilbert (of chemische sequentiebepaling, zoals het ook wordt genoemd) geen hybridisatiereacties. De methodologie bestaat uit het labelen met reactieve agentia aan het ene uiteinde, gevolgd door een zuiveringsproces.

Een van de negatieve aspecten van deze techniek ligt in de enorme complexiteit en het gebruik van chemicaliën die gevaarlijk zijn voor de gebruiker. Chemische breuken worden veroorzaakt door de toepassing van DMS, mierenzuur, hydrazine en hydrazine met zouten.

Werkwijze

Het protocol begint met het labelen aan het 5'-uiteinde van de streng met de fosformarker 32, waarna een chemische modificatie van de stikstofbase plaatsvindt en deze wordt gescheiden. Ten slotte vindt de splitsing van het abasische gebied plaats.

Eerst verkort u de reeks die u wilt rangschikken in kleinere segmenten. Deze stap wordt uitgevoerd met restrictie-enzymen, die resulteren in uitstekende uiteinden.

Vervolgens wordt de reactie uitgevoerd met een alkalische fosfatase, waarvan het doel is de fosfaatgroep te elimineren. Aldus kan een polynucleotidekinase worden gebruikt om de labeling uit te voeren.

De ketting is gedenatureerd (de twee strengen open). Vervolgens worden de chemicaliën aangebracht. Deze splitsingsreacties worden op een gecontroleerde manier uitgevoerd en het is bekend welke soorten bindingen elke toegepaste chemische stof breekt.

De resultaten lezen

Net als bij de Sanger-methode omvat het aflezen van de resultaten de scheiding op basis van grootte van de ketens die worden verkregen in een elektroforesesysteem. Systemen samengesteld uit polyacrylamide maken het mogelijk om een ​​zeer geschikte resolutie te verkrijgen voor het aflezen van de gel.

Massa-sequencing

De massale sequencing omvat een reeks nieuwe methoden, afgekort als NGS, van het Engelse "Next Generation Sequencing".

De methoden die als NGS zijn geclassificeerd, vereisen een eerdere DNA-amplificatiestap (ze werken niet met een enkel molecuul). Bovendien variëren de gebruikte platforms sterk. De principes van de meest populaire methoden worden hieronder beschreven:

Pyrosequencing

Het omvat het monitoren van de afgifte van een pyrofosfaat, die optreedt elke keer dat een nieuw nucleotide aan de DNA-streng wordt toegevoegd. Er wordt een systeem van enzymen aan elkaar gekoppeld, waardoor de emissie van licht (dat detecteerbaar is door een camera) plaatsvindt telkens wanneer een nieuw nucleotide wordt ingebouwd.

Het proces begint met de afzonderlijke incubatie van elke stikstofbase om te controleren of er al dan niet lichtemissie is. Pyrosequencing kan lange strengen lezen, maar het gevonden foutenpercentage is hoog.

Sequentiebepaling van synthese

Dit omvat de opname van gelabelde nucleotiden. Deze fluorescerende componenten worden toegevoegd, gewassen en het ingebouwde nucleotide wordt genoteerd. Vervolgens wordt het nucleotidelabel verwijderd en kan de synthese van de streng worden voortgezet. In de volgende stap zal ook een gelabeld nucleotide worden opgenomen en zullen de bovengenoemde stappen worden herhaald.

Een nadeel van deze techniek doet zich voor wanneer de fluorescerende markeringen niet volledig worden verwijderd. Deze emissies veroorzaken achtergrondfouten, resulterend in significante fouten.

Ligatie-sequencing

Deze techniek verschilt van de andere, omdat er geen gebruik wordt gemaakt van DNA-polymerase. In plaats daarvan is het sleutelenzym voor deze methodologie ligase. Hier worden fluorescent gelabelde DNA-fragmenten gebruikt, het wordt door het enzym gekoppeld en het wordt gedetecteerd.

Het grootste probleem met deze techniek is de korte fragmentlengte die het kan verwerken.

Ion Torrent-reeksen

Deze techniek is gebaseerd op de meting van het H ⁺ -ion dat vrijkomt bij elke opname van een nieuw nucleotide. Het principe lijkt veel op pyrosequencing, maar is veel goedkoper.

Voorbeelden

De sequentiebepaling van het menselijk genoom

Het sequencen van het menselijk genoom is een van de meest veelbelovende uitdagingen in de biologie geweest, maar ook een van de meest geprezen rivaliteit in de geschiedenis van de wetenschap. Voor de wetenschappers die bij het project betrokken waren, werd het sequencen van het genoom zelfs een wedstrijd.

In 1990 startte hij het zogenaamde "menselijk genoomproject", geleid door de beroemde wetenschapper, Nobelprijswinnaar James Watson. Na een jaar, in 1991, gaat Venter de uitdaging aan om Watson te "verslaan" en het genoom voor hem te sequencen. In 1992 ging Watson echter met pensioen en werd het commando overgenomen door een andere onderzoeker.

In 1995 kondigde Venter zijn succes aan in de volledige sequentiebepaling van een bacterieel genoom door middel van de willekeurige sequentiemethode. Evenzo kondigde het andere team een ​​jaar later de sequentiebepaling van het gistgenoom aan.

In 2000 werd de opleiding beëindigd. Beide bedrijven publiceerden hun voorlopige volledige genoomresultaten in twee van de meest prestigieuze wetenschappelijke tijdschriften: Nature en Science.

Wetenschappers bleven echter werken aan het verbeteren van de voorstellen en in 2006 werden de sequenties van bepaalde menselijke chromosomen voltooid.

Belang en toepassingen

Het kennen van de volgorde van de nucleotiden van zo'n belangrijk molecuul als DNA is waardevol voor biologen en aanverwante professionals. Deze keten van polynucleotiden bevat alle informatie die nodig is voor de ontwikkeling en instandhouding van alle vormen van leven.

Om deze redenen is kennis van deze sequentie essentieel voor biologisch onderzoek. In wezen maakt sequencing het mogelijk om een ​​van de belangrijkste eigenschappen van biologische systemen te meten en verschillen daartussen vast te stellen.

Sequentiebepaling wordt veel gebruikt door taxonomen en systematici, aangezien bepaalde DNA-sequenties het mogelijk maken om criteria vast te stellen om te concluderen of twee organismen al dan niet tot dezelfde soort behoren, naast de mogelijkheid om hypothesen voor te stellen over de fylogenetische relaties tussen beide.

Bovendien heeft DNA-sequencing toepassingen in de geneeskunde en diagnostiek. Zo zijn er goedkope en toegankelijke systemen die het door middel van sequencing mogelijk maken om de neiging tot het ontwikkelen van bepaalde ziekten (zoals kanker) te beoordelen met behulp van zogenaamde single nucleotide polymorphisms (SNP's).

Onderzoeken van het criminele en forensische type zijn ook verrijkt met sequentietechnieken, die kunnen worden gebruikt als betrouwbaar bewijs van de deelname van een bepaald individu aan een misdrijf.

Referenties

1. Heather, JM en Chain, B. (2016). De sequentie van sequencers: de geschiedenis van het sequencen van DNA. Genomics, 107 (1), 1-8.
2. Koboldt, DC, Steinberg, KM, Larson, DE, Wilson, RK en Mardis, ER (2013). De sequencing-revolutie van de volgende generatie en de impact ervan op genomics. Cell, 155 (1), 27-38.
3. Levy, J. (2010). Wetenschappelijke rivaliteit. Van Galileo tot het menselijk genoomproject. Redactioneel Paraninfo.
4. Sanger, F., Nicklen, S., & Coulson, AR (1977). DNA-sequentiebepaling met ketenbeëindigende remmers. Proceedings of the National Academy of Sciences, 74 (12), 5463-5467.
5. Schuster, SC (2007). Sequencing van de volgende generatie verandert de biologie van vandaag. Natuurmethoden, 5 (1), 16.
6. Xu, J. (Ed.). (2014). Sequencing van de volgende generatie. Caister Academic Press.