- Toepassingen
- Biochemie
- Auxotrofe markers
- De Ames-test
- Andere toepassingen voor de Ames-test
- Ontwikkeling van nieuwe soorten
- Antimutagenese
- Genotoxische metabolismestudies
- Evaluatie van mutagenen in biologische vloeistoffen
- Referenties
De prototrofen zijn organismen of cellen die de aminozuren kunnen produceren die nodig zijn voor hun levensprocessen. Deze term wordt over het algemeen gebruikt in relatie tot een bepaalde stof. Het is het tegenovergestelde van de term auxotroof.
Deze laatste term wordt gebruikt om een micro-organisme te definiëren dat alleen in een kweekmedium kan groeien en vermenigvuldigen als er een specifieke voedingsstof aan is toegevoegd. In het geval van de prototrofe kan hij gedijen zonder een dergelijke stof, omdat hij deze zelf kan produceren.
Eenvoudige vergelijking tussen auxotroof en prototroof. Genomen en bewerkt uit: Akardoust, van Wikimedia Commons.
Een organisme of een stam die bijvoorbeeld niet kan groeien in afwezigheid van lysine, zou auxotrofe lysine worden genoemd. De prototrofe lysinestam van zijn kant zal groeien en zich voortplanten onafhankelijk van de aan- of afwezigheid van lysine in het kweekmedium.
Kortom, een auxotrofe stam heeft een functionele metabole route verloren waardoor het een fundamentele stof kon synthetiseren die essentieel is voor zijn vitale processen.
Dit tekort is meestal te wijten aan een mutatie. De mutatie genereert een nul-allel dat niet de biologische capaciteit heeft om een stof te produceren die aanwezig is in de prototrofe.
Toepassingen
Biochemie
Auxotrofe genetische merkers worden vaak gebruikt in moleculaire genetica. Elk gen bevat de informatie die codeert voor een eiwit. Dat hebben onderzoekers George Beadle en Edward Tatum aangetoond in hun werk dat hen de Nobelprijs opleverde.
Deze specificiteit van de genen maakt het mogelijk om biosynthetische of biochemische routes in kaart te brengen. Een mutatie van een gen leidt tot een mutatie van een eiwit. Op deze manier kan in de auxotrofe stammen van de onderzochte bacteriën worden bepaald welke enzymen disfunctioneel zijn door mutaties.
Een andere methode om biosynthetische routes te bepalen, is het gebruik van auxotrofe stammen van specifieke aminozuren. In deze gevallen wordt de behoefte van de stammen aan dergelijke aminozuren benut om onnatuurlijke aminozuuranaloga van de eiwitten in de kweekmedia toe te voegen.
Bijvoorbeeld, substitutie van fenylalanine door para-azido fenylalanine in culturen van Escherichia coli-stammen die auxotroof zijn voor fenylalanine.
Auxotrofe markers
Mutaties in genen die coderen voor enzymen die deelnemen aan routes voor de biosynthese van metabolische bouwmoleculen worden gebruikt als markers in de overgrote meerderheid van genetische experimenten met gist.
Het door de mutatie veroorzaakte voedingstekort (auxotrofie) kan worden gecompenseerd door de benodigde voedingsstof in het groeimedium aan te voeren.
Een dergelijke compensatie is echter niet noodzakelijk kwantitatief omdat mutaties verschillende fysiologische parameters beïnvloeden en synergetisch kunnen werken.
Daarom zijn er studies uitgevoerd om prototrofe stammen te verkrijgen met het oog op het elimineren van auxotrofe markers en het verminderen van bias in fysiologische en metabolische studies.
De Ames-test
De Ames-test, ook wel de Salmonella-mutagenesetest genoemd, is in de jaren 70 ontwikkeld door Bruce N. Ames om te bepalen of een chemische stof een mutageen is.
Het is gebaseerd op het principe van omgekeerde mutatie of posterieure mutatie. Het gebruikt meerdere stammen van Salmonella typhimurium auxotroof voor histidine.
De kracht van een chemische stof om mutatie te veroorzaken, wordt gemeten door deze toe te passen op bacteriën op een plaat met histidine. De bacteriën worden vervolgens verplaatst naar een nieuwe histidine-arme plaque.
Als de stof niet mutageen is, zouden de bacteriën geen groei op de nieuwe plaque vertonen. In een ander geval zullen de histidine-auxotrofe bacteriën opnieuw muteren tot prototrofe histidinestammen.
Cultuur van de prototrofe bacterie Salmonella typhimurium. Genomen en bewerkt uit: Sun14916, van Wikimedia Commons
Vergelijking van het aandeel bacteriegroei in platen met en zonder behandeling maakt het mogelijk om de mutagene kracht van de verbinding op bacteriën te kwantificeren.
Dit mogelijke mutagene effect bij bacteriën duidt op de mogelijkheid om dezelfde effecten te veroorzaken bij andere organismen, inclusief de mens.
Aangenomen wordt dat een verbinding die een mutatie in bacterieel DNA kan veroorzaken, ook mutaties kan produceren die kanker kunnen veroorzaken.
Andere toepassingen voor de Ames-test
Ontwikkeling van nieuwe soorten
De Ames-test is toegepast om nieuwe bacteriestammen te verkrijgen. Er zijn bijvoorbeeld nitroreductase-deficiënte stammen ontwikkeld.
Deze stammen worden gebruikt om xenobiotisch metabolisme en DNA-reparatiesystemen te bestuderen. Ze zijn ook nuttig geweest om de metabolische mechanismen van nitrogroepen te beoordelen om actieve mutagenen te produceren, evenals de nitratiemechanismen van genotoxische verbindingen.
Antimutagenese
De Ames-test is ook gebruikt als een hulpmiddel om natuurlijke antimutagenen te bestuderen en te classificeren. Antimutagenen zijn verbindingen die mutagene laesies in het DNA kunnen verminderen, voornamelijk door hun reparatiesystemen te verbeteren.
Op deze manier vermijden dergelijke verbindingen de eerste stappen in de ontwikkeling van kanker. Sinds het begin van de jaren tachtig (20e eeuw) hebben Ames et al. Studies uitgevoerd om genotoxineverminderingen en kankerrisico's te evalueren door middel van een dieet dat rijk is aan antimutagens.
Ze merkten op dat populaties die diëten hadden met hoge niveaus van antimutagens een lager risico hadden op het ontwikkelen van gastro-enterische kanker.
De Ames-test is op grote schaal gebruikt om verschillende plantenextracten te bestuderen waarvan bekend is dat ze mutageniteit verminderen. Deze onderzoeken hebben ook aangetoond dat plantcomponenten niet altijd veilig zijn. Van veel eetbare planten is aangetoond dat ze genotoxische effecten hebben.
De Ames-test is ook nuttig gebleken bij het detecteren van de toxische of antimutagene effecten van natuurlijke verbindingen die vaak in alternatieve geneeswijzen worden gebruikt.
Genotoxische metabolismestudies
Een van de zwakke punten van de Ames-test was het gebrek aan metabolische activering van genotoxische verbindingen. Dit probleem is echter opgelost door de toevoeging van CYP-geïnduceerde leverhomogenaten bereid uit knaagdieren.
CYP is een hemoproteïne dat geassocieerd is met het metabolisme van verschillende stoffen. Deze wijziging heeft nieuwe mogelijkheden toegevoegd aan de Ames-test. Er zijn bijvoorbeeld verschillende inductoren van CYP's geëvalueerd, waaruit bleek dat deze enzymen worden geïnduceerd door verschillende soorten verbindingen.
Evaluatie van mutagenen in biologische vloeistoffen
Bij deze tests worden urine-, plasma- en serummonsters gebruikt. Ze kunnen nuttig zijn om de vorming van N-nitrosoverbindingen in vivo uit aminogeneesmiddelen te evalueren.
Ze kunnen ook nuttig zijn bij epidemiologische studies van menselijke populaties die zijn blootgesteld aan beroepsmutagene agentia, rookgewoonten en blootstelling aan milieuverontreinigende stoffen.
Deze tests hebben bijvoorbeeld aangetoond dat werknemers die aan afvalproducten worden blootgesteld, hogere niveaus van urinaire mutagene stoffen hebben dan degenen die in waterzuiveringsinstallaties werkten.
Het heeft ook gediend om aan te tonen dat het gebruik van handschoenen de concentraties van mutagene stoffen vermindert bij gieterijarbeiders die worden blootgesteld aan polycyclische aromatische verbindingen.
Onderzoek naar mutagenen in de urine is ook een waardevol hulpmiddel voor antimutagene evaluatie, aangezien deze test bijvoorbeeld heeft aangetoond dat de toediening van vitamine C de vorming van N-nitrosoverbindingen remt.
Het diende ook om aan te tonen dat het consumeren van groene thee gedurende een maand de concentratie van urinaire mutagene agentia vermindert.
Referenties
- BN Ames, J. McCann, E. Yamasaki (1975). Methoden voor het opsporen van carcinogene en mutagene agentia met de salmonella- / zoogdier-microsoom-mutageniteitstest. Mutatieonderzoek / omgevingsmutagenese en aanverwante onderwerpen.
- B. Arriaga-Alba, R. Montero-Montoya, JJ Espinosa (2012). De Ames-test in de eenentwintigste eeuw. Onderzoek en recensies: A Journal of Toxicology.
- Auxotrofie. Op Wikipedia. Hersteld van https://en.wikipedia.org/wiki/Auxotrophy.
- S. Benner (2001). Encyclopedia of Genetics. Academische pers.
- F. Fröhlich, R. Christiano, TC Walther (2013). Native SILAC: Metabole labeling van eiwitten in prototrofe micro-organismen op basis van lysinesyntheseregulatie. Moleculaire en cellulaire proteomica.
- M. Mülleder, F. Capuano, P. Pir, S. Christen, U.Sauer, SG Oliver, M. Ralser (2012). Een prototrofische deletiemutantcollectie voor gistmetabolomica en systeembiologie. Nature Biotechnology.