DNA-MICROARRAYS: PROCEDURE EN TOEPASSINGEN - BIOLOGIE - 2025

Een DNA-microarray , ook wel een DNA-chip of DNA-microarray genoemd, is samengesteld uit een reeks DNA-fragmenten die zijn verankerd op een fysieke drager van variabel materiaal, ofwel plastic of glas. Elk stukje DNA vertegenwoordigt een sequentie die complementair is aan een specifiek gen.

Het belangrijkste doel van microarrays is de vergelijkende studie van de expressie van bepaalde genen van belang. Het is bijvoorbeeld gebruikelijk dat deze techniek wordt toegepast op twee monsters - een in gezonde omstandigheden en een pathologisch - om te identificeren welke genen tot expressie worden gebracht en welke niet in het monster met de aandoening zitten. Het monster kan een cel of een weefsel zijn.

Door Paphrag op Engelse Wikipedia (overgedragen van en.wikipedia naar Commons.), Via Wikimedia Commons

Over het algemeen kan de expressie van genen worden gedetecteerd en gekwantificeerd dankzij het gebruik van fluorescerende moleculen. De manipulatie van de chips wordt in de meeste gevallen door een robot uitgevoerd en een groot aantal genen kan tegelijkertijd worden geanalyseerd.

Deze nieuwe technologie is bruikbaar voor een breed scala aan disciplines, van medische diagnostiek tot verschillende moleculaire biologiestudies op het gebied van proteomics en genomics.

Waar bestaat het uit?

DNA (deoxyribonucleïnezuur) microarrays zijn een reeks specifieke DNA-segmenten die aan een vaste matrix zijn bevestigd. Deze sequenties zijn complementair aan de genen die willen worden bestudeerd en er kan worden tot 10.000 genen per cm ² .

Deze kenmerken maken de systematische en massale studie van de genexpressie van een organisme mogelijk.

De informatie die een cel nodig heeft om te functioneren, wordt gecodeerd in eenheden die "genen" worden genoemd. Bepaalde genen bevatten de instructies voor het maken van essentiële biologische moleculen, eiwitten genaamd.

Een gen komt tot expressie als zijn DNA wordt getranscribeerd in een intermediair boodschapper-RNA-molecuul en de expressie van het gen kan variëren afhankelijk van het transcriptieniveau van dit DNA-segment. In bepaalde gevallen kan de verandering in expressie wijzen op ziekten.

Het principe van hybridisatie maakt de werking van microarrays mogelijk. DNA is een molecuul dat bestaat uit vier soorten nucleotiden: adenine, thymine, guanine en cytosine.

Om de dubbele helixstructuur te vormen, adeninegroepen met thymine en cytosine met guanine. Zo kunnen twee complementaire ketens worden verbonden door waterstofbruggen.

Soorten microarrays

In termen van de structuur van de microarrays zijn er twee variaties: het op maat gemaakte complementaire DNA of oligonucleotiden, en de commerciële microarrays met hoge dichtheid vervaardigd door commerciële bedrijven, zoals Affymetrix GeneChip.

Het eerste type microarray maakt de analyse van RNA van twee verschillende monsters op een enkele chip mogelijk, terwijl de tweede variant van het commerciële type is en een groot aantal genen heeft (de Affymetrix GeneChip heeft bijvoorbeeld ongeveer 12.000 menselijke genen) waardoor analyse een enkele steekproef.

Werkwijze

RNA-isolatie

De eerste stap bij het uitvoeren van een experiment met behulp van microarray-technologie is de isolatie en zuivering van de RNA-moleculen (het kan boodschapper-RNA of andere soorten RNA zijn).

Als je twee monsters wilt vergelijken (onder andere gezond versus ziek, controle versus behandeling), moet de isolatie van het molecuul in beide weefsels worden uitgevoerd.

Productie en labeling van cDNA

Vervolgens wordt het RNA onderworpen aan een reverse transcriptieproces in aanwezigheid van gelabelde nucleotiden en zo wordt het complementaire DNA of cDNA verkregen.

Het label kan fluorescerend zijn en moet onderscheidbaar zijn tussen de twee te analyseren weefsels. Op traditionele wijze worden de fluorescerende verbindingen Cy3 en Cy5 gebruikt, aangezien ze fluorescentie uitzenden bij verschillende golflengten. In het geval van Cy3 is het een kleur die dicht bij rood ligt en Cy5 komt overeen met het spectrum tussen oranje en geel.

Hybridisatie

De cDNA's worden gemengd en geïncubeerd in de DNA-microarray om hybridisatie mogelijk te maken (dwz binding vindt plaats) van het cDNA van beide monsters met het deel van het DNA dat is geïmmobiliseerd op het vaste oppervlak van de microarray.

Een hoger percentage hybridisatie met de sonde in de microarray wordt geïnterpreteerd als een hogere weefselexpressie van het overeenkomstige mRNA.

Systeem lezen

De kwantificering van de expressie wordt uitgevoerd door een lezersysteem op te nemen dat een kleurcode toewijst aan de hoeveelheid fluorescentie die door elk cDNA wordt uitgezonden. Als bijvoorbeeld rood wordt gebruikt om de pathologische aandoening te markeren en het hybridiseert in een grotere mate, zal de rode component de overheersende zijn.

Met dit systeem kan de overexpressie of onderdrukking van elk geanalyseerd gen onder beide geselecteerde omstandigheden bekend zijn. Met andere woorden, het transcriptoom van de monsters die in het experiment zijn geëvalueerd, kan bekend zijn.

Larssono, van Wikimedia Commons

Toepassingen

Momenteel worden microarrays beschouwd als zeer krachtige hulpmiddelen op medisch gebied. Deze nieuwe technologie maakt het mogelijk ziekten te diagnosticeren en een beter begrip te krijgen van hoe genexpressie wordt gewijzigd onder verschillende medische omstandigheden.

Bovendien maakt het de vergelijking mogelijk van een controleweefsel en een weefsel dat is behandeld met een bepaald medicijn, om de effecten van een mogelijke medische behandeling te bestuderen.

Om dit te doen, worden de normale toestand en de zieke toestand voor en na de toediening van het medicijn vergeleken. Door het effect van het medicijn op het genoom in vivo te bestuderen, hebben we een beter overzicht van het werkingsmechanisme. Het kan ook worden begrepen waarom sommige bepaalde medicijnen tot ongewenste bijwerkingen leiden.

Kanker

Kanker staat bovenaan de lijst van ziekten die zijn bestudeerd met DNA-microarrays. Deze methodologie is gebruikt voor de classificatie en prognose van de ziekte, met name in het geval van leukemie.

Het onderzoeksgebied van deze aandoening omvat de compressie en karakterisering van de moleculaire bases van kankercellen om patronen van genexpressie te vinden die resulteren in mislukkingen in de regulatie van de celcyclus en in de processen van celdood (of apoptose).

Andere ziekten

Door het gebruik van microarrays was het mogelijk om de differentiële expressieprofielen van genen in medische aandoeningen van allergieën, primaire immunodeficiënties, auto-immuunziekten (zoals reumatoïde artritis) en infectieziekten op te helderen.

Referenties

1. Bednar, M. (2000). DNA-microarraytechnologie en -toepassing. Medische wetenschapsmonitor, 6 (4), MT796-MT800.
2. Kurella, M., Hsiao, LL, Yoshida, T., Randall, JD, Chow, G., Sarang, SS, … & Gullans, SR (2001). DNA-microarray-analyse van complexe biologische processen. Tijdschrift van de American Society of Nephrology, 12 (5), 1072-1078.
3. Nguyen, DV, Bulak Arpat, A., Wang, N., & Carroll, RJ (2002). DNA-microarray-experimenten: biologische en technologische aspecten. Biometrie, 58 (4), 701-717.
4. Plous, CV (2007). DNA-microarrays en hun toepassingen in biomedisch onderzoek. CENIC Magazine. Biologische wetenschappen, 38 (2), 132-135.
5. Wiltgen, M., & Tilz, GP (2007). DNA-microarray-analyse: principes en klinische impact. Hematology, 12 (4), 271-287.