LÖWENSTEIN-JENSEN MEDIUM: FOUNDATION, VOORBEREIDING EN GEBRUIK - BIOLOGIE - 2026

Het Löwenstein-Jensen- medium is een selectief vast medium voor de isolatie en ontwikkeling van bacteriën van het geslacht Mycobacterium, zoals Mycobacterium tuberculosis, M. avium, met uitzondering van de leprae-soort, die niet kan worden gekweekt.

Bacteriën van het geslacht Mycobacterium groeien niet in conventionele kweekmedia, daarom was het nodig om een ​​speciaal medium te ontwerpen voor hun isolatie. Het originele medium is gemaakt door Löwenstein en later aangepast door Jensen.

Löwenstein-Jensen-medium met kolonies Mycobacterium tuberculosis. Bron: Agarwal et al / BioMed Central Ltd., met dank aan de Biology Image Library

De modificatie bestond in het elimineren van de Congo-rode kleurstof en deze te vervangen door een hogere concentratie malachietgroen. Het veranderde ook de concentraties magnesiumcitraat en monokaliumfosfaat.

Löwenstein-Jensen-medium bevat momenteel aardappelzetmeel, asparagine, magnesiumcitraat, monokaliumfosfaat, magnesiumsulfaat, malachietgroen, nalidixinezuur, cycloheximide, lincomycine, losgeklopte eieren, glycerine en water.

Mycobacteriën worden normaal gesproken geïsoleerd op plaatsen die niet steriel zijn, zoals sputum, urine, abcessen, onder andere. Dit betekent dat de meeste monsters de gebruikelijke microbiota van het gebied bevatten, plus de ziekteverwekker.

Dat is de reden waarom het Löwenstein-Jensen-medium een ​​reeks remmers in zijn samenstelling bevat, vertegenwoordigd door malachietgroen, antibiotica en antischimmelmiddelen.

Bovendien moeten monsters die afkomstig zijn van niet-steriele locaties, worden gedecontamineerd en geneutraliseerd voordat ze worden gezaaid in het Löwenstein-Jensen-medium.

Basis

De aanwezigheid van ei en glycerine in het Löwenstein-Jensen-medium stimuleert de groei van mycobacteriën omdat ze de vetzuren en eiwitten leveren die nodig zijn voor de ontwikkeling van deze micro-organismen.

Löwenstein-Jensen-medium bevat malachietgroen, wat een remmer is van de bijbehorende microbiota. Maar het bevat ook nalidixinezuur (35 µg / ml), dat de gramnegatieve microbiota remt, cycloheximide (400 µg / ml), dat saprofytische schimmels en gisten remt, en lincomycine (2 µ / ml), dat de grampositieve microbiota remt.

Sommige commerciële huizen geven er de voorkeur aan om de volgende combinatie van antibiotica toe te voegen: polymyxine B 200.000 eenheden / l, amfotericine B 10 mg / l, carbenicilline 50 mg / l en trimethoprim 10 mg / l.

Dit medium bevat geen agar, daarom vindt de stolling van het medium plaats door de coagulatie van het albumine dat tijdens de sterilisatie in het ei aanwezig is.

Voorbereiding

Weeg 37,3 g van het gedehydrateerde medium af in 600 ml gedestilleerd water waaraan vooraf 12 ml glycerol is toegevoegd. Het mengsel wordt verwarmd en regelmatig geroerd totdat het volledig is opgelost. Autoclaaf het medium gedurende 15 minuten bij 121 ° C.

Aan de andere kant moet een homogene suspensie van 1000 ml verse eieren worden bereid onder aseptische omstandigheden. Voeg de eiersuspensie toe aan de 600 ml medium bereid bij een temperatuur van 50-60 ° C en vermijd luchtbellen.

Antibiotische oplossingen worden ook toegevoegd na sterilisatie in de autoclaaf.

Giet het medium in steriele reageerbuizen met schroefdop. Verwarm de buizen 45 minuten schuin op 85 ° C.

De kleur van het bereide medium is aquamarijngroen en kan witachtige vlekken vertonen vanwege de aanwezigheid van lipiden in eieren.

De pH van het medium moet 7,2 ± 0,2 zijn

Bewaar buizen in de koelkast en bescherm ze tot gebruik tegen direct licht. Tempereer voor het zaaien.

Er is een modificatie van het medium genaamd "Gruft-modificatie van de Löwenstein Jensen". Dit bevat dezelfde verbindingen als het klassieke medium maar RNA-5 mg / 100 ml wordt toegevoegd, en als remmers bevat het malachietgroen 0,025 g / 100 ml, penicilline 50 U / ml en nalidixinezuur 35 ug / ml.

Toepassingen

Löwenstein-Jensen-medium wordt gebruikt voor het isoleren van mycobacteriën uit verschillende soorten monsters. Een Ziehl-Neelsen-kleuring wordt aanbevolen voor elk preparaat waarbij de aanwezigheid van mycobacteriën wordt vermoed.

Sommige monsters zijn afkomstig van steriele locaties, maar andere niet. Niet-steriele monsters moeten indien nodig worden ontsmet:

Sputum

Sputummonsters dienen als volgt te worden ontsmet: bepaal de hoeveelheid sputummonster in ml en voeg dezelfde hoeveelheid 4% NaOH toe aan het monster en incubeer bij 37 ° C.

Schud het mengsel regelmatig binnen 30 minuten. Centrifugeer vervolgens 30 minuten bij 3000 tpm.

Gooi het supernatant weg over een fenolische desinfecterende oplossing. Gebruik het bezinksel voor het zaaien, maar eerst moet de pH worden geneutraliseerd.

Om het sediment te neutraliseren, wordt 5% H ₂ SO ₄ gebruikt in aanwezigheid van de fenol rood indicator totdat het een neutrale pH bereikt die een zalmkleur veroorzaakt.

Maagspoeling, bronchiale spoeling en bronchiale aspiratie

In dit geval moet het monster gedurende 30 minuten bij 3000 RPM worden gecentrifugeerd. De supernatant wordt weggegooid en de pellet wordt gebruikt. Om het bezinksel te ontsmetten, voegt u 3 ml 4% NaOH toe en roert regelmatig gedurende een half uur bij 37 ° C.

Centrifugeer opnieuw, het supernatant wordt weggegooid en de pellet wordt gebruikt. Dit laatste moet worden geneutraliseerd zoals uitgelegd in het sputummonster.

Urine

Laat het monster 24 uur in de koelkast staan. Scheid het supernatant. De resterende pellet moet 30 minuten worden gecentrifugeerd bij 3000 RMP. Gooi het supernatant opnieuw weg en reconstitueer de pellet met 3 ml steriele fysiologische oplossing.

Voeg 3 ml 4% NaOH toe en ga verder met decontaminatie en neutralisatie zoals eerder beschreven.

Ascites-vloeistof, pleuravocht, cerebrospinale vloeistof

In dit type monster wordt het gecentrifugeerd en wordt het supernatant weggegooid. Voer een gram uit op het sediment of observeer direct onder de microscoop; Als er geen bacteriën worden waargenomen, is de decontaminatiestap niet nodig, noch de neutralisatiestap.

In dit geval kan het monster rechtstreeks met het sediment worden gezaaid. Als er bacteriën zijn, ga dan verder met decontamineren en neutraliseren zoals hierboven beschreven.

Biopsieën

Aan dit type monster moet 5 ml gedestilleerd water worden toegevoegd om later gedurende 10 minuten bij 1500 RPM te centrifugeren. Gooi het supernatant weg en centrifugeer de pellet opnieuw gedurende 30 minuten bij 3500 RPM. Gebruik het sediment om het kweekmedium in te zaaien.

Laryngeaal uitstrijkje

Het wattenstaafje moet in een steriele buis met gelijke delen gedestilleerd water en 4% NaOH worden geplaatst. Het wattenstaafje moet tegen de wanden van de buis worden gedrukt, zodat het monster wordt verdund in de vloeistof. Centrifugeer en gebruik het sediment. Neutraliseer het sediment zoals reeds beschreven.

Gezaaid

Het Löwenstein-Jensen-medium wordt geïnoculeerd door 0,5 ml van het monster op het oppervlak van het medium toe te voegen. Draai de buis om het monster door het medium te verdelen. Gebruik geen platina handvat.

Een tweede buis met Stonebrink-medium kan worden gezaaid om Mycobacterium bovis en andere soorten die niet groeien op Löwenstein-Jensen-medium te isoleren.

Incubatie

De geïnoculeerde buisjes worden aëroob geïncubeerd bij 37 ° C, met de dop enigszins los en onder een hoek van ongeveer 5 ° en beschermd tegen licht. Het milieu kan worden verrijkt met 5–10% kooldioxide. Controleer de culturen twee keer per week totdat er kolonies verschijnen.

Wanneer het monster is opgenomen, worden de doppen vastgedraaid. De maximale incubatietijd is 8 weken, als er na deze tijd geen groei is, wordt dit als negatief gerapporteerd.

QA

De volgende soorten kunnen worden gebruikt als kwaliteitscontrole:

Mycobacterium tuberculosis ATCC 27294, Mycobacterium kansasii ATCC 12478, Mycobacterium avium ATCC 19291, Mycobacterium bovis ATCC 19219, Mycobacterium fortuitum ATCC 6841, Escherichia coli ATCC 25922, Streptococcus pyogenes ATCC of 19615, Cryptococcus 320, Cryptococcus 320

Voor de eerste drie genoemde soorten wordt een uitstekende ontwikkeling verwacht, voor M. fortuitum zou de groei goed moeten zijn, terwijl voor M. bovis weinig of geen groei wordt verwacht. Ondertussen moeten andere soorten dan het geslacht Mycobacterium volledig worden geremd.

Beperkingen

Het voorbereide medium moet worden beschermd tegen licht, langdurige blootstelling aan licht zorgt ervoor dat het medium van groen naar blauw verandert, in dit geval kan het medium niet meer worden gebruikt. Dit komt omdat malachietgroen lichtgevoelig is.

Omdat het medium eieren bevat, kan het gemakkelijk worden besmet als het niet aseptisch wordt gehanteerd. Het kan worden opgelost als het wordt besmet met proteolytische bacteriën.

De kweek en manipulatie van bacteriën van het geslacht Mycobacterium vereist gekwalificeerd personeel, dat op de hoogte is van de bioveiligheidsmaatregelen die moeten worden gevolgd om besmetting of besmetting van anderen te voorkomen.

HCl mag niet worden gebruikt in de neutralisatiestap vanwege de vorming van natriumchloride, dat giftig kan zijn voor de bacil van Koch.

Monsters moeten gekoeld en beschermd tegen licht worden bewaard terwijl ze niet worden verwerkt.

Referentie

1. Francisco Soria Melguizo Laboratoria. 2009. Selectief medium Löwenstein-Jensen. Beschikbaar op: f-soria.es
2. Britannia Laboratories. 2017. Löwenstein-Jensen medium. Beschikbaar op: britanialab.com.
3. Neogen Laboratories. Löwenstein-Jensen medium. Beschikbaar op: foodsafety.neogen.com.
4. "Löwenstein-Jensen-medium." Wikipedia, de gratis encyclopedie. 20 november 2018, 15:15 UTC. 24 april 2019, 18:34. wikipedia.org
5. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Microbiologische diagnose. 5e druk. Redactioneel Panamericana SA Argentina.
6. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Bailey & Scott Microbiologische diagnose. 12 ed. Redactioneel Panamericana SA Argentina.
7. Mac Faddin J. (2003). Biochemische tests voor de identificatie van bacteriën van klinisch belang. 3e ed. Redactioneel Panamericana. Buenos Aires. Argentinië.