DAPI (4 ', 6-DIAMIDINO-2-FENYLINDOOL): KENMERKEN, GRONDGEDACHTE, GEBRUIK - CHEMIE - 2025

De DAPI (4 ', 6-diamidino-2-fenylindool) is een kleurstof door fluorescerende eigenschap die dient als een marker, veel gebruikt in de techniek van onder meer fluorescentiemicroscopie of flowcytometrie. De fluorescentie die het uitzendt is helderblauw, de excitatie vindt plaats tussen 455-461 nm (UV-licht).

DAPI-kleurstof kan met groot gemak het celmembraan van dode cellen passeren. Het kan ook de kernen van levende cellen kleuren, maar in dit geval moet de concentratie hiervan hoger zijn.

Chemische structuur van de fluorescerende kleurstof DAPI. Bron: Afbeelding: Bestand: DAPI.svg is een vectorversie van dit bestand. Het moet worden gebruikt in plaats van deze rasterafbeelding als het niet inferieur is / Richard Wheeler (Zephyris) Bewerkte afbeelding

De kleurstof heeft toegang tot cellulair DNA waarvoor het een speciale affiniteit heeft en bindt zich met grote gretigheid aan de stikstofbasen adenine en thymine. Om deze reden is het erg nuttig bij sommige technieken van de moleculaire biologie.

Deze verbinding behoort tot de groep van indoolkleurstoffen en er is aangetoond dat ze een grotere gevoeligheid hebben voor DNA dan ethidiumbromide en propidiumjodide, vooral op agarosegels.

Het gebruik van deze fluorescerende kleurstof is erg breed, omdat het nuttig is voor: het bestuderen van veranderingen in DNA in apoptotische processen (celdood) en dus het detecteren van cellen in dit proces; voor DNA-voetafdrukfoto (DNA-fotoprinting); om bacteriële besmetting te bestuderen; of om nucleaire segmentatie te visualiseren.

Het is ook gebruikt bij de studie van chromosomale banden, bij de detectie van Mycoplasmas sp DNA, bij de DNA-eiwit interactie, bij het kleuren en tellen van cellen door immunofluorescentie en zelfs om volwassen stuifmeelkorrels te kleuren.

kenmerken

DAPI is de afkorting van de chemische naam (4 ', 6-diamidino-2-fenylindool). Zijn moleculaire formule is C ₁₆ H ₁₅ N _5. Het heeft een molecuulgewicht van 350,3. Nabij het UV-lichtbereik (345 tot 358 nm) treedt de maximale excitatie van het DAPI-DNA-complex op, terwijl de maximale fluorescentie-emissie optreedt tussen 455-461 nm.

Deze kleurstof wordt gekenmerkt als een geel poeder, maar de structuren die zijn gemarkeerd met deze fluorofoor, zenden een schitterend blauw licht uit.

Het is een verbinding die oplosbaar is in water, maar om het oplossen ervan te versnellen kan enige warmte worden toegepast. Het kan worden verdund met PBS maar niet direct erin worden opgelost.

Als de kleurstof eenmaal is bereid, moet deze in het donker worden bewaard, dat wil zeggen, beschermd tegen licht, bij een temperatuur van 2 tot 8 ° C (koelkast). Onder deze omstandigheden is de kleurstof meer dan 3 weken of maanden stabiel.

Als het wordt beschermd tegen licht maar bij kamertemperatuur wordt bewaard, daalt de stabiliteit tot 2 of 3 weken, maar als het wordt blootgesteld aan direct licht, gaat het snel achteruit. Als u veel langer wilt bewaren, kan het in aliquots worden gekoeld tot -20 ° C.

Basis

Deze kleuring is gebaseerd op het genereren van een nucleaire tegenkleuring in de belangrijkste moleculaire biologietechnieken, zoals: flowcytometrie, fluorescentiemicroscopie en kleuring van onder meer metafasechromosomen of interfase-kernen.

Deze techniek is gebaseerd op de grote affiniteit die de kleurstof heeft voor de stikstofhoudende basen (adenine en thymine) in het genetisch materiaal (DNA) in de kleine groef. Terwijl het op het cytoplasmatische niveau zeer weinig achtergrond laat.

Wanneer de fluorescerende kleurstof zich bindt aan de adenine- en thyminegebieden van DNA, neemt de fluorescentie aanzienlijk toe (20 keer meer). De kleur die het afgeeft is helderblauw. Met name is er geen fluorescentie-emissie bij binding aan GC (guanine-cytosine) basenparen.

Het is belangrijk op te merken dat hoewel het ook affiniteit heeft voor RNA, dit geen probleem oplevert, omdat de hoogste mate van energie-emissie van dit molecuul plaatsvindt bij een andere golflengte (500 nm), in tegenstelling tot DNA dat dit doet bij 460 nm. Bovendien is de toename in fluorescentie eenmaal gebonden aan RNA slechts 20%.

DAPI wordt meer gebruikt om dode (gefixeerde) cellen te kleuren dan levende cellen, aangezien een veel hogere concentratie van de kleurstof nodig is om de laatste te kleuren, dit komt doordat het celmembraan veel minder doorlaatbaar is voor DAPI als het levend is.

DAPI-kleurstof kan worden gebruikt in combinatie met rode en groene fluoroforen voor een meerkleurenervaring.

Gebruik

DAPI (4 ', 6-diamidino-2-fenylindool) is een uitstekende fluorofoor en wordt daarom veel gebruikt in verschillende technieken en voor verschillende doeleinden. Hieronder wordt het gebruik van DAPI in de belangrijkste technieken uitgelegd.

Flowcytometrie

De onderzoekers Gohde, Schumann en Zante waren in 1978 de eersten die DAPI gebruikten en voorstelden als een fluorofoor in de flowcytometrie-techniek, met groot succes vanwege de hoge gevoeligheid voor DNA en de hoge intensiteit in fluorescentie-emissie.

Het gebruik van DAPI in deze techniek maakt het mogelijk de celcyclus te bestuderen, cellen te kwantificeren en levende en dode cellen te kleuren.

Hoewel er andere kleurstoffen zijn, zoals ethidiumbromide, Hoechst-oxide, acridine-sinaasappel en propidiumjodide, is DAPI een van de meest gebruikte kleurstoffen omdat het meer fotostabiel is dan de eerder genoemde.

Voor deze techniek is het nodig om de cellen te fixeren, hiervoor kan absolute ethanol of 4% paraformaldehyde worden gebruikt. Het monster wordt gecentrifugeerd en het supernatant wordt weggegooid, vervolgens worden de cellen gehydrateerd door 5 ml PBS-buffer gedurende 15 minuten toe te voegen.

Terwijl de tijd verstrijkt, bereidt u de DAPI-kleuring voor met een kleuringsbuffer (FOXP3 van BioLegend) met een concentratie van 3 µM.

Centrifugeer het monster, gooi het supernatant weg en bedek het vervolgens met 1 ml DAPI-oplossing gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.

Breng het monster met de geschikte laser naar de flowcytometer.

Flow microfluorometrie

Een andere techniek waarin DAPI wordt gebruikt, is in flow-microfluorometrie samen met een andere fluorofoor, mithramycine genaamd. Beide zijn nuttig voor het afzonderlijk kwantificeren van chloroplast-DNA, maar DAPI is het meest geschikt voor het meten van T4-bacteriofaagdeeltjes.

Hybridisatie

Deze techniek maakt in feite gebruik van DNA-sondes die zijn gelabeld met een fluorescerende kleurstof die DAPI kan zijn.

Het monster heeft een warmtebehandeling nodig om het dubbelstrengs DNA te denatureren en om te zetten in twee enkelstrengs strengen. Het wordt vervolgens gehybridiseerd met een DAPI-gelabelde gedenatureerde DNA-probe die een sequentie van belang heeft.

Later wordt het gewassen om te elimineren wat niet gehybridiseerd was, een contrast wordt gebruikt om het DNA te visualiseren. De fluorescentiemicroscoop maakt observatie van de gehybridiseerde sonde mogelijk.

Deze techniek heeft als doel om specifieke sequenties in chromosomaal DNA te detecteren en de diagnose van bepaalde ziekten te kunnen stellen.

Deze cyto-moleculaire technieken hebben enorm geholpen bij het bepalen van details in de studie van karyotypen. Hij heeft bijvoorbeeld de basenparenrijke gebieden van adenosine en thymine getoond, heterochromatische gebieden of DAPI-banden genoemd.

Deze techniek wordt veel gebruikt voor de studie van chromosomen en chromatine bij planten en dieren, en voor de diagnose van prenatale en hematologische pathologieën bij mensen.

Bij deze techniek is de aanbevolen DAPI-concentratie 150 ng / ml gedurende 15 minuten.

Geassembleerde objectglaasjes moeten beschermd tegen licht worden bewaard bij 2-8 ° C.

Immunofluorescentiekleuring

Cellen worden gefixeerd met 4% paraformaldehyde. Als er andere kleuringen moeten worden gebruikt, blijft DAPI aan het einde als tegenkleuring achter en worden de cellen gedurende 15 minuten bedekt met PBS-oplossing. Bereid na verloop van tijd de DAPI-oplossing door te verdunnen met PBS, zodat de uiteindelijke concentratie 300 µM is.

Vervolgens wordt de overtollige PBS verwijderd en gedurende 5 minuten bedekt met DAPI. Wast meerdere keren. Het objectglaasje wordt bekeken onder een fluorescentiemicroscoop onder het juiste filter.

Veiligheidsblad

Met deze stof moet voorzichtig worden omgegaan, want het is een stof die mutagene eigenschappen heeft. Actieve kool wordt gebruikt om deze verbinding te verwijderen uit waterige oplossingen die moeten worden weggegooid.

Handschoenen, schort en veiligheidsbril moeten worden gebruikt om ongelukken met dit reagens te voorkomen. Als er contact met de huid of slijmvliezen optreedt, moet het gebied met voldoende water worden gewassen.

Pipetteer dit reagens nooit via de mond, gebruik pipetten.

Vervuil het reagens niet met microbiële middelen, aangezien dit tot foutieve resultaten zal leiden.

Verdun de DAPI-vlek niet meer dan aanbevolen, omdat dit de kwaliteit van de vlek aanzienlijk zal verminderen.

Stel het reagens niet bloot aan direct licht en houd het niet warm, aangezien dit de fluorescentie vermindert.

Referenties

1. Brammer S, Toniazzo C en Poersch L. Corantes vaak betrokken bij cytogenetica van planten. Arq Inst. Biol. 2015, 82. Verkrijgbaar bij: scielo.
2. Impath Laboratories. DAPI. Beschikbaar op: menarinidiagnostics.com/
3. Cytocell Laboratoria. 2019. Instructies voor het gebruik van DAPI. beschikbaar op cytocell.com
4. Elosegi A, Sabater S. Concepten en technieken in rivierecologie. (2009). Redactioneel Rubes, Spanje. Beschikbaar op: books.google.co.ve/
5. Novaes R, Penitente A, Talvani A, Natali A, Neves C, Maldonado I. Gebruik van fluorescentie in een gemodificeerde dissector-methode om het aantal myocyten in hartweefsel te schatten. Arch. Bras. Cardiol. 2012; 98 (3): 252-258. Verkrijgbaar vanaf: scielo.
6. Rojas-Martínez R, Zavaleta-Mejía E, Rivas-Valencia P. Aanwezigheid van fytoplasma's in papaja (Carica papaya) in Mexico. Chapingo Magazine. Tuinbouwserie, 2011; 17 (1), 47-50. Beschikbaar op: scielo.org.