HOGEDRUKVLOEISTOFCHROMATOGRAFIE (HPLC): GRONDGEDACHTE, APPARATUUR, TYPEN - CHEMIE - 2026

De high-performance vloeistofchromatografie is een instrumentele techniek die wordt gebruikt bij chemische analyses waarbij afzonderlijke mengsels zijn toegestaan, de componenten worden gezuiverd en gekwantificeerd, en verdere studies. Het is bekend onder de afkorting HPLC, afgeleid van het Engels: High Performance Liquid Chromatography.

Dus, zoals de naam aangeeft, werkt het door vloeistoffen te manipuleren. Deze bestaan ​​uit een mengsel dat is samengesteld uit de analyt of het monster van interesse en een of meer oplosmiddelen die als mobiele fase fungeren; dat wil zeggen degene die de analyt door alle HPLC-apparatuur en de kolom sleept.

HPLC-apparatuur. Bron: Dqwyy

HPLC wordt veel gebruikt door kwaliteitsanalyselaboratoria in veel bedrijven; zoals geneesmiddelen en voedsel. De betrokken analist moet het monster voorbereiden, de mobiele fase, de temperatuur en andere parameters controleren en de flesjes in het wiel of de carrousel plaatsen zodat de apparatuur de injecties automatisch kan uitvoeren.

De HPLC-apparatuur is gekoppeld aan een computer waarmee de gegenereerde chromatogrammen kunnen worden waargenomen, evenals om de analyses te starten, de stroom van de mobiele fase te regelen, het type elutie (isocratisch of gradiënt) te programmeren en de detectoren in te schakelen (UV -Vis of massaspectrofotometer).

Basis

In tegenstelling tot conventionele vloeistofchromatografie, zoals met papier of silicagel gevulde kolomchromatografie, is HPLC niet afhankelijk van de zwaartekracht voor de vloeistof om de stationaire fase te bevochtigen. In plaats daarvan werkt het met hogedrukpompen, die de mobiele fase of het eluens met grotere intensiteit door de kolom irrigeren.

Op deze manier is het niet nodig om de mobiele fase af en toe door de kolom te gieten, maar doet het systeem dit continu en met hogere stroomsnelheden.

Maar de efficiëntie van deze techniek is niet alleen te danken aan dit detail, maar ook aan de kleine vulstofdeeltjes waaruit de stationaire fase bestaat. Omdat het kleiner is, is het contactoppervlak met de mobiele fase groter, dus het zal beter interageren met de analyt en zijn moleculen zullen meer scheiden.

Deze twee kenmerken, plus het feit dat de techniek het koppelen van detectoren mogelijk maakt, maken HPLC veruit superieur aan dunnelaagchromatografie of papierchromatografie. Scheidingen zijn efficiënter, de mobiele fase reist beter door de stationaire fase en chromatogrammen kunnen elke storing in de analyse detecteren.

Uitrusting

Vereenvoudigd diagram van de werking van HPLC-apparatuur. Bron: Gabriel Bolívar.

Hierboven ziet u een vereenvoudigd diagram van hoe een HPLC-apparatuur werkt. De oplosmiddelen bevinden zich in hun respectievelijke containers, gerangschikt met slangen zodat de pomp een klein volume ervan in de apparatuur brengt; we hebben dus de mobiele fase.

De mobiele fase of het eluens moet eerst worden ontgast, zodat de bellen geen invloed hebben op de scheiding van de analytmoleculen, die zich mengen met de mobiele fase zodra de apparatuur de injecties heeft uitgevoerd.

De chromatografische kolom bevindt zich in een oven die het mogelijk maakt om de temperatuur te regelen. Voor verschillende monsters zijn er dus voldoende temperaturen om scheidingen met hoge prestaties te bereiken, evenals een brede catalogus van kolommen en soorten vullingen of stationaire fasen voor specifieke analyse.

De mobiele fase met de opgeloste analyt komt de kolom binnen, en daaruit elueren de moleculen die minder affiniteit "voelen" met de stationaire fase eerst, terwijl de moleculen die er meer door worden vastgehouden later elueren. Elk geëlueerd molecuul genereert een signaal dat wordt weergegeven op het chromatogram, waar de retentietijden van de gescheiden moleculen worden waargenomen.

En aan de andere kant komt de mobiele fase na het passeren van de detector in een afvalcontainer terecht.

HPLC-typen

Er zijn veel soorten HPLC, maar de meest opvallende zijn de volgende vier.

Normale fasechromatografie

Normale fasechromatografie verwijst naar een fase waarbij de stationaire fase polair van aard is, terwijl de mobiele fase niet-polair is. Hoewel het normaal wordt genoemd, wordt het in feite het minst gebruikt, waarbij de omgekeerde fase het meest wijdverbreid en efficiënt is.

Omgekeerde fasechromatografie

Omdat het een inverse fase is, is de stationaire fase nu apolair en de mobiele fase polair. Dit is vooral handig bij biochemische analyse, omdat veel biomoleculen beter oplossen in water en in polaire oplosmiddelen.

Ionenuitwisselingschromatografie

Bij dit type chromatografie beweegt de analyt, met een positieve of negatieve lading, door de kolom en vervangt de ionen die erin zitten. Hoe hoger de lading, hoe hoger de retentie, daarom wordt het veel gebruikt om ionische complexen van overgangsmetalen te scheiden.

Grootte-uitsluitingschromatografie

Deze chromatografie, in plaats van te scheiden, is verantwoordelijk voor het zuiveren van het resulterende mengsel. Zoals de naam doet vermoeden, wordt de analyt niet langer gescheiden afhankelijk van hoe nauw hij verwant is aan de stationaire fase, maar volgens zijn grootte en molecuulgewichten.

Kleinere moleculen zullen meer worden vastgehouden dan grote moleculen, aangezien deze niet tussen de poriën van de polymere kolomvullingen worden opgesloten.

Toepassingen

HPLC maakt zowel kwalitatieve als kwantitatieve analyse mogelijk. Aan de kwalitatieve kant kan de aanwezigheid van een bepaalde verbinding worden gedetecteerd door de retentietijden van het chromatogram onder bepaalde omstandigheden te vergelijken. Een dergelijke aanwezigheid kan een aanwijzing zijn voor ziekte, vervalsing of drugsgebruik.

Daarom is het een computeronderdeel van diagnostische laboratoria. Evenzo wordt het aangetroffen in de farmaceutische industrie, omdat het het mogelijk maakt om de zuiverheid van het product te verifiëren, evenals de kwaliteit ervan met betrekking tot het oplossen in de maagomgeving. Uitgangsmaterialen worden ook onderworpen aan HPLC om ze te zuiveren en betere prestaties bij de synthese van geneesmiddelen te garanderen.

HPLC maakt analyse en scheiding mogelijk van complexe mengsels van eiwitten, aminozuren, koolhydraten, lipiden, porfyrines, terpenoïden, en is in wezen een uitstekende optie voor het werken met plantenextracten.

En tot slot kunt u met moleculaire uitsluitingschromatografie polymeren van verschillende groottes selecteren, aangezien sommige kleiner of groter kunnen zijn dan andere. Op deze manier worden producten verkregen met een laag of hoog gemiddeld molecuulgewicht, hetgeen bepalend is voor hun eigenschappen en toekomstige toepassingen of synthese.

Referenties

1. Day, R., & Underwood, A. (1989). Kwantitatieve analytische chemie. (vijfde ed.). PEARSON Prentice Hall.
2. Bussi Juan. (2007). Krachtige vloeistofchromatografie. . Hersteld van: fing.edu.uy
3. Wikipedia. (2019). Krachtige vloeistofchromatografie. Hersteld van: en.wikipedia.org
4. Clark Jim. (2007). Krachtige vloeistofchromatografie. Hersteld van: chemguide.co.uk
5. Matthew Barkovich. (5 december 2019). Krachtige vloeistofchromatografie. Chemie LibreTexts. Hersteld van: chem.libretexts.org
6. Huisarts Thomas. (15 april 2013). Hoge prestatie vloeistofchromatografie (HPLC) - methoden, voordelen en toepassingen. Hersteld van: azom.com