FOSFAATBUFFER (PBS): GRONDGEDACHTE, BEREIDING EN GEBRUIK - BIOLOGIE - 2026

De fosfaatbuffer, fosfaatgebufferde zoutoplossing of BPS is een isotoon buffer, waarvan de functie is om de pH en de osmotische druk zo dicht mogelijk bij de natuurlijke biologische omgeving (fysiologisch) te houden. De afkorting PBS staat voor fosfaatgebufferde zoutoplossing.

PH en osmolariteit zijn twee zeer belangrijke aspecten die in bepaalde laboratoriumprotocollen moeten worden gecontroleerd. In het geval van de pH is het essentieel dat deze wordt gecontroleerd, vooral bij biochemische reacties, aangezien deze kunnen variëren of niet kunnen worden uitgevoerd als de reactanten een ongeschikte pH hebben.

PBS-fosfaatgebufferde zoutoplossing bij twee verschillende pH-waarden. Bron: Pixinio.com

Hoewel de controle van de osmolariteit essentieel is, vooral bij het werken met levende cellen, omdat de plasmamembranen van de cellen reageren volgens de concentratie opgeloste stoffen waarin ze worden aangetroffen.

Als de cellen worden overgebracht naar een hypertoon medium, zullen ze uitgedroogd raken, omdat de watergradiënt naar de kant wordt getransporteerd waar zich een hogere concentratie opgeloste stoffen bevindt. Als cellen daarentegen in een hypotoon medium worden geplaatst, zullen de cellen vloeistof opnemen totdat ze zijn gelyseerd.

Daarom wordt PBS-buffer gebruikt voor laboratoriumprotocollen die het onderhoud van cellen in vitro vereisen, op deze manier worden de cellen niet beschadigd.

PBS bestaat uit een combinatie van zouten, zoals natriumchloride, natriumfosfaat, kaliumchloride en kaliumfosfaat. De samenstelling van de PBS kan variëren, afhankelijk van het protocol.

Basis

In wezen is de functie van de fosfaatbuffer het handhaven van een constante fysiologische pH samen met een elektrolytconcentratie die vergelijkbaar is met die in het lichaam.

In deze omgeving kunnen cellen stabiel blijven, omdat fysiologische omstandigheden zoveel mogelijk worden nagebootst.

Andere verbindingen kunnen indien nodig aan de oorspronkelijke PBS-formulering worden toegevoegd, de toevoeging van EDTA aan de buffer is bijvoorbeeld nuttig voor het wassen van rode bloedcellen in de kruis-incompatibiliteitstest.

EDTA voorkomt dat de fractie van complement C1 die in het serum aanwezig is, wordt gesplitst en gelyseerd naar de rode bloedcellen, dat wil zeggen dat het valse incompatibiliteitsresultaten vermijdt. Bovendien helpt EDTA om cellen te dissociëren.

Voorbereiding

De hoeveelheid zouten die moeten worden afgewogen voor de bereiding van de PBS-fosfaatgebufferde zoutoplossing is afhankelijk van de hoeveelheid die moet worden bereid:

-Fosfaatgebufferde zoutoplossing voorraadoplossing (10X PBS)

Voor één liter oplossing:

Wegen:

80,6 g NaCl,

2,2 g KCl,

11,5 g Na ₂ HPO ₄ ,

2,0 g KH ₂ HPO ₄

Voorbereidingstechniek

Doe de zware zouten in een bekerglas, voeg voldoende water (80%) toe en meng op de roerplaat met magneetstaaf tot de zouten zijn opgelost.

Bereiding van PBS met behulp van een roerplaat met een magnetische staaf. Bron: Gebruiker: Ruhrfisch, Wikipedia. com

Filter om onopgeloste deeltjes te verwijderen. Gebruik filters met poriën van 0,45 µm. Autoclaaf en aseptisch verdelen in een laminaire stroomkap in glazen potten met deksel.

De 10X-oplossing (geconcentreerd) past de pH niet aan. De aanpassing wordt gemaakt zodra het is verdund tot de 1X PBS-bufferconcentratie (1:10 verdunning).

-Buffer fosfaat zoutoplossing (1X PBS)

De 1X PBS kan direct worden bereid door de overeenkomstige hoeveelheden van elk zout te wegen of het kan worden bereid door de stockoplossing (1:10) te verdunnen met steriel gedestilleerd water.

-Om direct een liter 1X PBS-fosfaatgebufferde zoutoplossing te bereiden, weegt u:

8,06 g NaCl,

0,22 g KCl,

1,15 g Na ₂ HPO ₄ ,

0,20 g KH ₂ HPO ₄

Voorbereidingstechniek

Ga verder zoals uitgelegd in de geconcentreerde oplossing. Vervolgens moet de pH worden aangepast. Om dit te doen, meet u de pH en gebruikt u, afhankelijk van het resultaat, zuur (HCl) of base (NaOH) om de pH naar behoefte te verlagen of te verhogen, totdat deze 7,4 is.

Het zuur of de base wordt druppelsgewijs toegevoegd terwijl de pH-waarde van de oplossing wordt bewaakt met een pH-meter. Filter, autoclaaf en aseptisch verdeel in conische buizen of potten indien nodig.

-Om 1X PBS uit de 10X stockoplossing te bereiden:

Maak een verdunning van 1:10. Om bijvoorbeeld 1 liter 1X PBS te bereiden, meet u 100 ml van de stockoplossing af en voegt u 700 ml steriel gedestilleerd water toe. Pas de pH aan en vul de hoeveelheid water tot 1000 ml.

De bereide PBS-buffer is kleurloos en helder.

Dagelijkse PBS kan op kamertemperatuur worden bewaard en de rest in de koelkast.

Oplossingen voor pH-aanpassing

HCl

Voor 100 ml 1 molair HCL (zoutzuur).

Meet 91 ml gedestilleerd water af en plaats het in een bekerglas van 250 ml.

Meet 8,62 ml geconcentreerd HCl af en voeg het langzaam toe aan het bekerglas met het water (doe het nooit andersom). Bij de omgang met sterke zuren (sterk bijtende stof) passende bioveiligheidsmaatregelen nemen.

Mix 5 minuten bij voorkeur met een roerplaat met een magneetstaaf in het glas. Breng over in een kolf van 100 ml en vul aan tot 100 ml met gedestilleerd H ₂ O.

NaOH

Voor 100 ml NaOH (natriumhydroxide) 10 molair.

Meet 40 ml gedestilleerd water af en plaats het in een bekerglas van 250 ml. Meet 40 g NaOH af en voeg toe aan het water. Meng met behulp van een roerplaat met een magnetische staaf in het glas.

Breng over in een maatkolf van 100 ml en vul aan tot de maatstreep met gedestilleerd water. Voldoen aan de bioveiligheidsvoorschriften, omdat deze reactie exotherm is (er komt energie vrij in de vorm van warmte).

Als u andere hoeveelheden fosfaatzoutoplossing wilt bereiden, kunt u de volgende tabel raadplegen:

Bron: «Laboratorium voor Virale en Menselijke Genomica, UASLP School of Medicine»

Toepassingen

Het wordt voornamelijk gebruikt in celbiologie, immunologie, immunohistochemie, bacteriologie, virologie en onderzoekslaboratoria.

Het is ideaal voor het wassen van cellen door centrifugatie (rode bloedcellen), het wassen van monolagen van cellen, in spectroscopische ellipsometrie-technieken, bij de kwantificering van bacteriële biofilms, bij het in stand houden van celculturen voor virussen, als wasoplossing bij de indirecte immunofluorescentietechniek. en in technieken voor de karakterisering van monoklonale antilichamen.

Het wordt ook gebruikt om cellen of weefsels te transporteren, als verdunningsmiddel voor het tellen van cellen, de bereiding van cellulaire enzymen (trypsine), als verdunningsmiddel voor de biomolecuul-uitdroogmethode en om andere reagentia te bereiden.

Aan de andere kant hebben Martin et al. In 2006 aangetoond dat PBS nuttig is in forensische wetenschappelijke laboratoria, met name bij het herstel van sperma uit vaginale uitstrijkjes, of bij het herstel van vaginale cellen uit penisuitstrijkjes. Op deze manier kan worden vastgesteld of er een seksuele relatie is geweest.

Beperkingen

-Sommige PBS-buffers bevatten een stof genaamd natriumazide als conserveermiddel. Deze verbinding kan explosieve stoffen produceren als deze in contact komt met lood of koper. Om deze reden moet speciale aandacht worden besteed aan het afvoeren van dit reagens in de afvoer. Als het op deze manier wordt weggegooid, moet er veel water worden toegevoegd om het zo veel mogelijk te verdunnen.

-Zink mag niet aan de fosfaatbuffer worden toegevoegd, omdat hierdoor sommige zouten neerslaan.

-Wangen et al.In 2018 vastgesteld dat het gebruik van PBS niet geschikt was voor het wassen van primaire acute myeloïde leukemie (AML) -cellen die uit perifeer bloed zijn gehaald, vanwege het feit dat veel cellen verloren gaan door lysis, met een grote afname van het materiaal eiwit.

Daarom stelden ze vast dat primaire AML-cellen na opslag in vloeibare stikstof niet met PBS mogen worden gewassen.

Referenties

1. Coll J. (1993). Diagnostische technieken in virologie. Ed Díaz de Santos. 360 pag
2. Rodríguez M, Ortiz T. Celcultuur. Verandering van medium. Afdeling Normale en Pathologische Cytologie en Histologie Universiteit van Sevilla. Beschikbaar op personal.us.es
3. Bereiding van met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS). (2008). Standard Operating Procedures (SOP's) Laboratorium voor menselijke en virale genomica UASLP School of Medicine. Beschikbaar op: genomica.uaslp.mx
4. "Fosfaatbuffer zoutoplossing." Wikipedia, de gratis encyclopedie. 3 april 2019, 19:36 UTC. 13 april 2019, 02:57 en.wikipedia.org.
5. Pietrasanta L, Von-Bilderling C. Onderwerpen in moleculaire biofysica. Beschikbaar op: users.df.uba.ar
6. Rediar. Handleiding. PBS + EDTA. Beschikbaar op: felsan.com.ar
7. Martin NC, Pirie AA, Ford LV, Callaghan CL, McTurk K, Lucy D, Scrimger DG. Het gebruik van fosfaatgebufferde zoutoplossing voor het herstel van cellen en spermatozoa uit wattenstaafjes. Sci Justice. 2006; 46 (3): 179-84. Beschikbaar in: ncbi.nlm.nih.gov
8. Wangen R, Aasebø E, Trentani A, et al. Bewaarmethode en wassen met fosfaatgebufferde zoutoplossing beïnvloeden het acute myeloïde leukemie-proteoom. Int J Mol Sci. 2018; 19 (1): 296. Beschikbaar in: ncbi.nlm.nih.gov
9. Martínez R, Gragera R. (2008). Theoretische en praktische grondslagen van histochemie. Hoge Raad voor Wetenschappelijk Onderzoek. Madrid. Beschikbaar op: books.google.co.ve