OXIDASE-TEST: GRONDGEDACHTE, PROCEDURE EN TOEPASSINGEN - BIOLOGIE - 2025

De oxidase-test is een diagnostische methode die de aanwezigheid van het enzymcomplex cytochroomoxidase c aantoont. Dit systeem induceert de transformatie van gereduceerd cytochroom naar geoxideerd, omdat het zuurstof vangt en dit op zijn beurt fungeert als de laatste elektronenacceptor (H ⁺ ) in de ademhalingsketen.

De term oxidase is een verkorte manier om te verwijzen naar het enzym cytochroomoxidase, ook wel bekend als indofenoloxidase. In de oudheid werd aangenomen dat de enzymen cytochroomoxidase en indofenoloxidase twee verschillende enzymen waren, maar tegenwoordig is bekend dat ze hetzelfde zijn.

Positieve en negatieve oxidase-test. Bron: geen machineleesbare auteur opgegeven. Alpha.prim ~ commonswiki aangenomen (op basis van auteursrechtclaims).

Cytochromen zijn van hun kant hemoproteïnen die ijzer bevatten en het cytochroomoxidase-systeem voltooien. Cytochromen kunnen van soort tot soort verschillen.

Er zijn verschillende soorten cytochromen (cytochromen a1, a2, a3 en 0). Sommige bacteriën kunnen er maar één produceren, maar andere wel twee of drie tegelijk. In die zin staat de aanwezigheid van cytochroom a en a3 bekend als cytochroom oxidase c. Dit is het type cytochroom dat de oxidase-test detecteert.

De geslachten Neisseria en Pseudomonas bevatten cytochroomoxidase c. Deze geslachten geven de positieve oxidase-test, waardoor ze worden onderscheiden van respectievelijk de Acinetobacter- en Stenotrophomonas-genera.

Er zijn ook andere geslachten die oxidase-positief zijn.

Basis

Kenmerken van het cytochroomoxidase c-systeem

Het cytochroom oxidase c systeem werkt op de volgende manier: oxidase-positieve micro-organismen gebruiken zuurstof om energie op te wekken door middel van aerobe ademhaling. Dit systeem werkt dankzij het transport van elektronen van donorsubstanties zoals NADH ⁺ naar receptorsubstanties, in dit geval zuurstof.

Dit resulteert in de productie van energie (ATP) en water of waterstofperoxide, afhankelijk van het cytochroomoxidase-systeem dat het micro-organisme bezit.

Dat is de reden waarom de meeste oxidase-positieve bacteriën ook catalase-positief zijn, een noodzakelijke voorwaarde om het geproduceerde waterstofperoxide te elimineren, aangezien deze stof giftig is voor de bacteriën.

Het cytochroomoxidase c-systeem is aanwezig in sommige aërobe bacteriën, sommige facultatieve anaëroben, enkele microaërofiele bacteriën en geen strikte anaëroben. Dit laatste is begrijpelijk, aangezien strikte anaëroben niet in de aanwezigheid van zuurstof kunnen leven en daarom het cytochroomoxidase-systeem missen.

Test principe

In deze test worden stoffen gebruikt die als kunstmatige elektronenacceptoren werken en natuurlijke stoffen binnen de elektronentransportketen vervangen.

Er worden voornamelijk kleurstoffen zoals parafenyleendiamine en indofenol gebruikt, die fungeren als receptorsubstraten en kunstmatige elektronendonoren.

Parafenyleendiamine wordt geoxideerd door het cytochroomoxidase c-systeem. De kleurstof in zijn gereduceerde vorm is kleurloos, maar in zijn geoxideerde vorm is hij gekleurd.

Dit is hoe de aanwezigheid van het cytochroomoxidase c-systeem wordt bewezen; omdat een positieve reactie een lavendelblauwe of blauwpaarse kleur zal genereren, afhankelijk van het gebruikte reagens.

Aan de andere kant, als de laatste elektronenaccepterende stof in de ademhalingsketen anders is dan zuurstof, zal de oxidase-test negatief zijn (er is geen kleurproductie); dit is het geval met anaërobe micro-organismen.

Evenzo, als het cytochroom dat door het micro-organisme wordt gebruikt, verschilt van cytochroomoxidase c, zal het ook de negatieve test geven.

Werkwijze

Er zijn verschillende reagentia en protocollen voor de oxidase-test, allemaal voor hetzelfde doel.

Reagentia

Kovacs-reagens, Gordon- en McLeod-reagens, Nadi-reagens, Carpenter, Suhrland- en Morrison-reagens en gebruik van oxidase-schijven.

-Kovacs oxidase reagens

Het bestaat uit 1% tetramethyl-p-fenyleendiaminedihydrochloride.

Het reagens van Kovacs wordt bereid door 1 g van de bovengenoemde stof op te lossen in 50 ml gedestilleerd water. Het wordt subtiel verwarmd totdat het volledig is opgelost. Doe over in een amberkleurige fles met voldoende capaciteit en vul aan tot 100 ml met gedestilleerd water. Wacht minimaal 15 minuten voor gebruik. Bewaar in een koelkast, beschermd tegen licht.

Het is gelabeld als Kovacs-oxidase-reagens, om het te onderscheiden van het Kovacs-reagens dat wordt gebruikt om de indooltest te onthullen. Dit reagens is het meest gevoelige, minder giftige maar duurder dan de rest van de reagentia.

Een positieve reactie zal worden aangetoond met dit reagens waarbij de kleur van de kolonie verandert in lavendel, dat snel paars, bijna zwart wordt. Een negatieve reactie is duidelijk omdat er geen kleurverandering in de kolonie is of het een licht roze kleur aanneemt. Het medium kan ook donkerder worden, maar dat betekent niet dat er een positieve reactie is.

Bij dit reagens is de reactietijd cruciaal, een kleurverandering tussen 5 en 15 seconden wordt als een positieve reactie beschouwd.

-Gordon en McLeod-reagens

Het is samengesteld uit dimethyl-p-fenyleendiamine-dihydrochloride, ook bekend als N-dimethyl-p-fenyleendiamine of p-aminodimethylaniline-monohydrochloride. Het wordt bereid zoals beschreven voor het Kovacs-oxidase-reagens, ter vervanging van de betrokken stof.

Dit reagens is iets stabieler dan Kovacs-oxidase-reagens, hoewel alle reagentia die p-fenyleendiamine bevatten, instabiel zijn.

Deze reactie is later, het wordt als positief geïnterpreteerd met het verschijnen van een blauwpaarse kleur binnen 10 tot 30 minuten.

-Nadi-reagens

Het is samengesteld uit 1% α-naftol in ethylalcohol (95% ethanol) en 1% aminodimethylaniline. Het mengsel wordt in gelijke delen bereid met absolute ethylalcohol als verdunningsmiddel tot een voldoende hoeveelheid van 100 ml.

-Carpenter, Suhrland en Morrison-reagens

Het is samengesteld uit 1% p-aminodimethylalanineoxalaat. Bereid op dezelfde manier voor als beschreven voor Kovacs-oxidase-reagens, verander voor de overeenkomstige stof.

Met de oplossing gereed, worden teststrips als volgt bereid: Whatman nr. 1 filtreerpapierstrips van 6-8 cm worden geïmpregneerd met 1% dimethyl-p-fenyleendiamineoxalaatreagens.

Ze mogen drogen zonder contact met metaal, bewaren in potten met schroefdop met droogmiddel en bewaren in de koelkast. Deze strips zijn tot 6 maanden houdbaar.

Het is het meest stabiele reagens van alle genoemde, en kan in oplossing tot 6 maanden meegaan. Een ander pluspunt is dat het het medium rond de kolonie niet kleurt, als het direct op de plaat wordt gebruikt.

Het verschijnen van een rode kleur wordt geïnterpreteerd als een positieve test.

-Oxidase-schijven

Het zijn commerciële schijven die zijn geïmpregneerd met reagens voor de oxidase-test. Er zijn verschillende commerciële merken op de markt.

Het gebruik ervan is vrij praktisch, omdat het niet nodig is om nieuwe reagentia te bereiden, wat het werk vergemakkelijkt. De verkregen resultaten zijn betrouwbaar zolang de schijven goed worden bewaard.

Protocollen

Directe plaatmethode, indirecte methode op papier en gebruik van schijven geïmpregneerd met oxidase reagentia.

-Directe bordmethode

2 of 3 druppels van een van de bovengenoemde reagentia worden voor dit doel direct op de kolonie (s) toegevoegd in een plaat met kweekmedium dat geen glucose bevat.

De verandering of niet van kleur van de kolonies wordt geïnterpreteerd, niet het medium. De geldige reactietijd is afhankelijk van het gebruikte reagens.

-Indirecte methode op papier

Snijd een stuk filtreerpapier (Whatman nr. 1) af op 6 cm ² en plaats het in een lege petrischaal.

Voeg 2 of 3 druppels van het Kovacs-oxidase-reagens toe aan het papier, neem een ​​deel van de te bestuderen kolonie op met een platina handvat of een houten tandenstoker en verdeel het in een rechte lijn over het met reagens geïmpregneerde papier. Interpreteer binnen 5 tot 10 seconden.

Met de strips die zijn voorbereid met Carpenter, Suhrland en Morrison-reagens, wordt een kolonie op de droge strip verspreid. Een enkele strip wordt gebruikt om verschillende stammen te testen. Interpreteer in 10 sec.

-Schijven (m

Bevochtig de commerciële schijven subtiel met steriel gedestilleerd water en leg ze over de te bestuderen kolonie. Het wordt aanbevolen om de platen op 35 ° C te gebruiken, als platen op kamertemperatuur of gekoelde platen worden gebruikt, is de reactie iets langzamer. Interpreteer de kleurverandering tussen 10 en 20 seconden.

Kolonies op bloed- of chocoladeagar kunnen worden gebruikt.

-Disks (indirecte methode)

Bevochtig de schijf zoals eerder beschreven. Leg het in een lege petrischaal. Neem een ​​voldoende hoeveelheid van de kolonie om te studeren met een platina handvat of een houten tandenstoker en plaats deze op de schijf. Interpreteer de kleurverandering tussen 10 en 20 seconden.

Gebruik

Het geslacht Neisseria en Acinetobacter lijken soms morfologisch erg op elkaar, want hoewel het geslacht Acinetobacter een Gram-negatieve staaf is, kan het soms een coccoïde vorm aannemen en in paren worden verdeeld, wat het geslacht Neisseria simuleert.

In dit geval is de oxidase-test echt nuttig. Het geslacht Neisseria is positief en Acinetobacter negatief.

Het geslacht Moraxella lijkt echter sterk op het geslacht Neisseria en beide geven een positieve reactie; Dit is de reden waarom koolhydraatfermentatietesten altijd moeten worden uitgevoerd voor definitieve identificatie.

Anderzijds is de oxidase-test nuttig om een ​​bacterie die behoort tot de Enterobacteriaceae-familie (alle oxidase-negatief) te onderscheiden van andere fermentoren, zoals het geslacht Pasteurella, Aeromonas, Plesiomonas (oxidase-positief).

Het geslacht Vibrio en Helicobacter zijn ook oxidase-positief.

QA

Gebruik bekende stammen van Escherichia coli als een negatieve controle en stammen van Pseudomonas aeruginosa als een positieve controle.

Beperkingen

-De reagentia moeten vers bereid worden gebruikt, hun houdbaarheid in oplossing bij kamertemperatuur is kort omdat ze erg onstabiel zijn. Gekoeld kunnen ze 5 dagen tot 2 weken meegaan.

-De reagentia zijn kleurloos; als ze van kleur veranderen, moeten ze worden weggegooid. Beschadigde schijven verschijnen omdat ze na verloop van tijd donkerder worden.

-Een positieve reactie met het Kovacs-oxidase-reagens tussen 15-60 seconden wordt als een vertraagde reactie beschouwd en na 60 seconden moet deze als negatief worden beschouwd.

-Haemophylus influenzae geeft een negatieve oxidase-reactie als een reagens met dimethyl-p-fenyleendiamine wordt gebruikt, maar positief als het Kovacs-oxidase-reagens (tetramethyl-p-fenyleendiamine) wordt gebruikt.

-Mediums die glucose bevatten, interfereren met de test en geven vals-negatieven.

-Bordetella pertussis-stammen kunnen een vals-positieve reactie geven als ze afkomstig zijn van sterk geconcentreerde bloedagarplaten.

-Het gebruik van metalen (ijzeren) handvatten geeft een vals positieve reactie.

aanbevelingen

-Omdat de reagentia erg onstabiel zijn en de neiging hebben tot zelfoxidatie, wordt aanbevolen porties van 1 tot 2 ml in te vriezen en indien nodig te verwijderen.

-Een andere manier om de auto-oxidatie van het reagens te vertragen, is door 0,1% ascorbinezuur toe te voegen bij het bereiden van de reagentia.

-Aangezien de reagentia instabiel zijn, wordt een wekelijkse kwaliteitscontrole aanbevolen.

-Reagentia die de kwaliteitscontroletest niet doorstaan, mogen niet worden gebruikt.

Referenties

1. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Microbiologische diagnose. 5e druk. Redactioneel Panamericana SA Argentina.
2. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Bailey & Scott Microbiologische diagnose. 12 ed. Redactioneel Panamericana SA Argentina.
3. "Oxidase Test." Wikipedia, de gratis encyclopedie. 15 januari 2018, 10:32 UTC. 3 april 2019, 14:03
4. Wereldgezondheidsorganisatie. Laboratoriumhandleiding voor de identificatie en het testen van antimicrobiële gevoeligheid van bacteriële pathogenen die van belang zijn voor de volksgezondheid in de ontwikkelingswereld.2004. Beschikbaar op: who.int/drugresistance/infosharing
5. Reagensstrips voor de diagnose van oxidase-activiteit bij bacteriën. Rev Cubana Med Trop. 2000; 52 (2): 150-151.