IMMUNOFLUORESCENTIE: GRONDGEDACHTE, PROTOCOL EN TOEPASSINGEN - BIOLOGIE - 2025

De immunofluorescentie is een krachtige immunokleuringstechniek waarbij gebruik wordt gemaakt van antilichamen die covalent zijn gebonden aan fluorescerende moleculen om specifieke doelwitten te identificeren in celmonsters die op een vaste drager zijn bevestigd.

Deze techniek omvat microscopische observatie met immunologische specificiteit, waardoor het mogelijk wordt om levende of dode cellen te observeren die minuscule hoeveelheden antigenen kunnen bevatten. Het wordt veel gebruikt, zowel op het gebied van onderzoek als bij de klinische diagnose van verschillende pathologieën.

Immunolabeling van actinefilamenten in cardiomyocytcellen (Bron: Ps1415 via Wikimedia Commons)

Deze techniek, voornamelijk kwalitatief (met enkele kwantitatieve varianten), heeft specifiek te maken met de visualisatie van een monster door het productsignaal van een fluorofoor, een fluorescerend molecuul dat is gebonden aan een antilichaam en dat kan worden geëxciteerd bij een bepaalde golflengte. .

In de cellulaire context is het erg nuttig om de aan- / afwezigheid en subcellulaire locatie van eiwitten te bestuderen. De techniek werd aanvankelijk in de klinische setting gebruikt voor de diagnose van virussen zoals influenza en vervolgens voor vele andere infectieziekten.

Het is een zeer gevoelige techniek en met de juiste microscopie-apparatuur kan het een zeer goede resolutie hebben. Het vereist, voor zijn waarneming, het gebruik van confocale of epifluorescentiemicroscopen.

Ondanks het feit dat het erg populair is, kan het enkele belangrijke problemen opleveren met betrekking tot het verkrijgen van niet-specifieke fluorescentie die wat achtergrondruis genereert, wat vaak het goed aflezen van de resultaten beperkt.

Basis

Immunofluorescentie is gebaseerd op het benutten van het biologische fenomeen van de interactiereactie tussen een antilichaam en een antigeen. Het heeft specifiek te maken met de visualisatie of detectie van deze reactie door fluorescerende moleculen te exciteren tot een specifieke golflengte.

Een antilichaam is een immunoglobuline-eiwit dat wordt uitgescheiden door actieve B-cellen en dat specifiek wordt gegenereerd tegen een antigeen waaraan het met hoge affiniteit en specificiteit kan binden. Immunofluorescentie maakt gebruik van IgG-immunoglobulinen, die oplosbaar worden gevonden in bloedserum.

Antilichamen zijn moleculen tot 950 kDa die bestaan ​​uit twee korte (lichte) en twee lange "Y" -vormige (zware) peptideketens. Zowel de lichte als de zware ketens zijn verdeeld in twee domeinen: de ene variabele, die het antigeen kan herkennen, en de andere constant of geconserveerd, kenmerkend voor elke soort.

Antigenen worden functioneel gedefinieerd als moleculen die kunnen worden herkend door een antilichaam en zijn voor het grootste deel eiwitten. Wanneer een dier wordt blootgesteld aan een antigeen, worden de lymfocyten van het immuunsysteem geactiveerd, waardoor er specifieke antilichamen tegen worden aangemaakt en die functioneren als een afweersysteem.

Een antigeen, zoals een eiwit, kan bijvoorbeeld meer dan één epitoop of herkenningsplaats door een antilichaam hebben, dus het serum van het dier dat aan een antigeen is blootgesteld, kan polyklonale antilichamen hebben tegen verschillende gebieden van hetzelfde eiwit.

Immunofluorescentie maakt dan gebruik van het vermogen van een dier om polyklonale antilichamen tegen een specifiek antigeen te produceren om het te zuiveren en vervolgens te gebruiken voor de detectie van hetzelfde antigeen in andere contexten.

Tot de fluorescerende kleurstoffen of moleculen die het meest worden gebruikt voor sommige immunofluorescentietechnieken behoren fluoresceïne-isothiocyanaat (FITC), tetramethylrhodamine-isothiocyanaat-5 en 6 (TRITC), veel cyanines zoals Cy2, Cy3, Cy5 en Cy7 en kleurstoffen genaamd Alexa Fluor® , zoals de Alexa Fluor®448.

Protocol

Het immunofluorescentieprotocol varieert echter afhankelijk van vele factoren, en in grote lijnen omvat het een lineaire reeks stappen, bestaande uit:

• Voorbereiding van de platen en cellen
• Fixatie van monsters
• Permeabilisatie
• Blokkeren
• Immunokleuring of immunokleuring
• Montage en observatie

-Voorbereiding

Van de monsters

De voorbereiding van de monsters hangt af van hun aard en het soort ervaring dat moet worden uitgevoerd. Het eenvoudigste geval, waarbij cellen in suspensie worden gebruikt, wordt hieronder uitgelegd.

Cellen in suspensie, dat wil zeggen in een vloeibaar kweekmedium, moeten er eerst door centrifugeren van worden gescheiden en vervolgens worden gewassen met een bufferoplossing of isosmotische "buffer", die hun integriteit behoudt.

Normaal gesproken wordt een fosfaat-zoutbuffer gebruikt die bekend staat als PBS, waarin de cellen worden geresuspendeerd en dit mengsel opnieuw wordt gecentrifugeerd om de cellen vrij te maken van het kweekmedium dat storende stoffen kan bevatten.

Van de messen

De objectglaasjes die worden gebruikt voor microscopische observatie, waar de cellen later zullen worden gefixeerd voor de overeenkomstige stroomafwaartse behandelingen, moeten ook zorgvuldig worden voorbereid.

Deze worden bedekt of "gesensibiliseerd" met een oplossing van polylysine, een synthetisch polymeer dat zal werken als een "moleculaire lijm" tussen de cellen en de vaste drager, dankzij de elektrostatische interactie tussen de positieve ladingen van hun aminogroepen en de negatieve ladingen op de eiwitten die cellen omhullen.

Fixatie van monsters

Dit proces bestaat uit het immobiliseren van de eiwitten die in de cel worden aangetroffen om hun ruimtelijke locatie intact te houden. De gebruikte moleculen moeten alle soorten celmembranen kunnen passeren en roosters kunnen vormen met covalente eiwitten.

Formaldehyde en paraformaldehyde, glutaaraldehyde en zelfs methanol worden veel gebruikt, waarmee celmonsters een bepaalde tijd worden geïncubeerd en vervolgens worden gewassen met een isosmotische bufferoplossing.

Nadat de cellen zijn gefixeerd, worden ze verder vastgemaakt aan de vellen die eerder met polylysine waren gesensibiliseerd.

Permeabilisatie

Afhankelijk van het type test dat wordt uitgevoerd, zal het nodig zijn om de cellen die worden onderzocht door te laten of niet. Als men de locatie, aan- of afwezigheid van een bepaald eiwit op het celoppervlak wil weten, is permeabilisatie niet nodig.

Aan de andere kant, als je de locatie van een eiwit in de cel wilt weten, is permeabilisatie essentieel en zal bestaan ​​uit het incuberen van de monsters met Triton X-100, een detergent dat celmembranen kan permeabiliseren.

Blokkeren

Een fundamentele stap in alle immunologische technieken is het blokkeren. In dit stadium van de procedure bestaat het blokkeren uit het bedekken, op de gevoelig gemaakte platen, van alle plaatsen met polylysinemoleculen waaraan cellen niet hechten. Dat wil zeggen, het voorkomt elke niet-specifieke unie.

Normaal gesproken worden oplossingen met bovien serumalbumine (BSA) in PBS-buffer gebruikt voor het blokkeren en de beste resultaten worden verkregen naarmate de incubatietijd met deze oplossing langer is. Na elke stap, inclusief het blokkeren, is het nodig om de resterende oplossing af te spoelen.

Immunokleuring of immunokleuring

De immunokleuring of immunokleuring-procedure zal voornamelijk afhangen van of het een directe of indirecte immunofluorescentie is (zie hieronder).

Als het een primaire of directe immunofluorescentie is, worden de monsters geïncubeerd met de gewenste antilichamen, die moeten worden gekoppeld aan de fluorescerende kleurstoffen. De incubatieprocedure bestaat uit het maken van een verdunning van het antilichaam in een oplossing die ook BSA zal bevatten, maar in een lagere verhouding.

Als het om een ​​secundaire of indirecte immunofluorescentie gaat, moeten twee opeenvolgende incubaties worden uitgevoerd. Eerst met de gewenste antilichamen en daarna met de antilichamen die de constante gebieden van de primaire immunoglobulinen kunnen detecteren. Het zijn deze secundaire antilichamen die covalent aan fluoroforen worden gebonden.

De techniek is zeer veelzijdig en maakt gelijktijdige labeling van meer dan één antigeen per monster mogelijk, zolang er in het geval van directe immunofluorescentie primaire antilichamen zijn gekoppeld aan verschillende fluoroforen.

Voor gelijktijdige labeling bij indirecte immunofluorescentie, is het noodzakelijk ervoor te zorgen dat elk primair antilichaam wordt geproduceerd in een ander dier, en dat elk secundair antilichaam is gekoppeld aan een andere fluorofoor.

Net als blokkeren geeft incubatie met antilichamen betere resultaten naarmate dit langer duurt. Na elke stap is het nodig om de overtollige antilichamen die niet aan de monsters bonden weg te wassen en in de secundaire immunofluorescentie is het nodig om te blokkeren voordat het secundaire antilichaam wordt toegevoegd.

Bepaalde technieken gebruiken andere kleuringen die geen verband houden met immunokleuring, zoals het kleuren van nucleair DNA met de DAPI-fluorofoor.

Montage en observatie

Tijdens de laatste incubatietijd met de fluoroforen is het noodzakelijk dat de monsters in het donker blijven. Voor observatie onder de microscoop is het gebruikelijk om sommige stoffen te gebruiken om de fluorescentie van de fluoroforen gekoppeld aan de antilichamen te behouden.

Soorten

Grafische samenvatting van directe en indirecte immunofluorescentie (Bron: Westhayl618 via Wikimedia Commons)

Directe of primaire immunofluorescentie

Het heeft te maken met de detectie van antigenen door het gebruik van fluorescerende antilichamen. Het belangrijkste voordeel van het gebruik van deze techniek is de snelheid, maar er kunnen veel gevallen van niet-specifieke binding optreden tijdens het proces, vooral bij het bestuderen van menselijke sera, omdat ze rijk zijn aan zeer heterogene antilichamen.

Indirecte of secundaire immunofluorescentie

Het wordt ook wel de "sandwich" -techniek genoemd en hierbij wordt de techniek in twee stappen ontwikkeld. Het eerste heeft te maken met het gebruik van een niet-fluorescerend antilichaam en de binding ervan aan het antigeen van belang.

Tegen het constante gebied van dit eerste antilichaam (dat nu als antigeen zal dienen) wordt een tweede antilichaam gebruikt dat het kan herkennen, dat is geassocieerd met een fluorescerend molecuul.

Het verschijnen van een fluorescerend signaal zal het resultaat zijn van specifieke herkenning tussen het eerste niet-fluorescerende antilichaam en het antigeen van belang; de aanwezigheid van dit eerste antilichaam conditioneert die van het tweede, dat gelabeld is en waardoor de aan- of afwezigheid van het antigeen kan worden bepaald.

Ondanks dat het een veel tijdrovender techniek is dan directe immunofluorescentie (aangezien het nog een incubatiestap omvat), omvat deze techniek niet het ontwerp van een fluorescerend antilichaam voor elk antigeen dat wordt bestudeerd, wat in economische termen resulteert meer levensvatbaar.

Bovendien is het een gevoeliger techniek in termen van signaalversterking, aangezien meer dan één secundair antilichaam kan binden aan het constante gebied van het primaire antilichaam, waardoor de intensiteit van het fluorescentiesignaal wordt versterkt.

Toepassingen

Zoals eerder opgemerkt, is immunofluorescentie een buitengewoon veelzijdige techniek, die op wetenschappelijk en klinisch gebied een veelvoud aan toepassingen heeft gekregen. Het kan worden gebruikt om ecologische, genetische en fysiologische vragen over veel organismen te beantwoorden.

Onder de klinische toepassingen wordt het gebruikt voor de directe diagnose van sommige dermatologische aandoeningen, hetzij met behulp van directe of indirecte immunofluorescentie op epitheelweefsel van de bestudeerde patiënten.

Immunofluorescentietechnieken zijn beschikbaar in eencellige organismen zoals gist om intranucleaire en cytoplasmatische microtubuli, actine en geassocieerde eiwitten, 10 nm filamenten en andere bestanddelen van het cytoplasma, membraan en celwanden zichtbaar te maken.

Referenties

1. Abcam, immunocytochemie en immunofluorescentieprotocol. Opgehaald van abcam.com
2. Greph, C. (2012). Fluorescerende kleurstoffen. Opgehaald van leica-microsystems.com
3. Miller, DM en Shakest, DC (1995). Immunofluorescentiemicroscopie. In Methods in Cell Biology (Vol. 48, pp. 365-394). Academic Press, Inc.
4. Odell, ID, & Cook, D. (2013). Immunofluorescentietechnieken. Journal of Investigative Dermatology, 133, 1-4.
5. Princle, BJR, Adams, AEM, Druain, DG en Brian, K. (1991). Immunofluorescentiemethoden voor gist. In Methods of Enzymology (Deel 194, pp. 565-602). Academic Press, Inc.
6. Schaeffer, M., Orsi, E. V, & Widelock, D. (1964). Toepassingen van immunofluorescentie in de volksgezondheidsvirologie. Bacteriological Reviews, 28 (4), 402-408.
7. Vrieling, EG en Anderson, DM (1996). Immunofluorescentie in fytoplanktononderzoek: toepassingen en potentieel. J: Phycol. , 32, 1-16.