LIA (LYSINE IJZER) AGAR: BASIS, BEREIDING EN TOEPASSINGEN - BIOLOGIE - 2025

De agar LIA (Lysine Iron) is een biochemische test die wordt gebruikt om bacteriën van de Enterobacteriaceae-familie te identificeren. Dit medium is gemaakt door Edwards en Fife, op basis van de Falkow-formule.

Oorspronkelijk was deze test een bouillon die peptonen, gistextract, glucose, L-lysine, broomkresolpaars en gedestilleerd water bevatte. Edwards en Fife voegden agar-agar, ijzerammoniumcitraat en natriumthiosulfaat toe.

Positieve en negatieve test voor lysinedecarboxylering. Bron: foto- en diagrameigenschap van de auteur MSc. Marielsa gil

De test bestaat in wezen uit het aantonen van de aanwezigheid van het enzym lysine decarboxylase, dat kan reageren met de carboxylgroep van het aminozuur L-lysine. Een deaminatie van het aminozuur kan ook optreden door de aanwezigheid van het enzym lysine deaminase.

Bovendien toont de samenstelling van het medium het vermogen van sommige bacteriegeslachten om waterstofsulfide te produceren. Ten slotte is het ook mogelijk om de vorming van gas in het medium waar te nemen.

Basis

Peptonen en gistextract

Zoals de meeste kweekmedia bevat Lysine Iron Agar componenten die de bron van voedingsstoffen vormen die nodig zijn voor bacteriegroei. Deze componenten worden vertegenwoordigd door peptonen en gistextract.

Glucose

Evenzo bevat deze agar glucose als fermenteerbare koolhydraten. Van alle bacteriën in de Enterobacteriaceae-familie is bekend dat ze glucose fermenteren.

Deze stap is cruciaal, omdat het verantwoordelijk zal zijn voor het verzuren van het medium, een essentiële voorwaarde voor het enzym lysine decarboxylase, indien aanwezig, om op zijn substraat in te werken.

In sommige bacteriegeslachten kan gasproductie als gevolg van glucosefermentatie worden waargenomen.

Het gas wordt aangetoond wanneer er een verplaatsing van de agar in de buis is, waardoor een lege ruimte op de bodem ervan achterblijft, of door het medium in twee of meer porties te breken.

L-lysine

Zodra lysine is gedecarboxyleerd, worden diamine (cadaverine) en kooldioxide gevormd.

Decarboxylering vindt plaats in aanwezigheid van het co-enzym pyridoxaalfosfaat. Deze reactie is onomkeerbaar.

PH-indicator (broomcresol paars)

Alle pH-veranderingen die optreden in het medium door de verschillende reacties worden gedetecteerd door de paarse broomcresol pH-indicator.

In die zin wordt het medium bij verzuring geel en bij alkalisatie keert het medium terug naar de oorspronkelijke paarse of paarse kleur.

Wanneer lysinedeaminering optreedt als gevolg van de aanwezigheid van het lysinedeaminase-enzym, wordt een roodachtige kleur gevormd op het oppervlak, typisch voor de geslachten Proteus, Providencia en sommige Morganella-soorten.

Dit komt door het feit dat alfa-keto-carbonzuur wordt gevormd tijdens het deamineringsproces, dat reageert met ammoniumcitraat in aanwezigheid van zuurstof, waardoor de bovengenoemde kleur ontstaat.

IJzerammoniumcitraat en natriumthiosulfaat

Anderzijds, bacteriën produceren waterstofsulfide wordt aangetoond door de aanwezigheid van natriumthiosulfaat (zwavelbron) en ferri-ammoniumcitraat, die de ontwikkelaar van H ₂ S.

Bacteriën die het enzym thiosulfaat reductase de mogelijkheid te werken door vermindering van het natriumthiosulfaat onderhavige vorming sulfiet en waterstofsulfide (H ₂ S).

Dit laatste is een kleurloos gas, maar vormt bij reactie met het ijzerzout ferrometaalsulfide, een onoplosbare verbinding (zichtbaar zwart neerslag).

Het vermogen tot vorming van H ₂ S met dit medium is niet erg betrouwbaar, omdat sommige lysine decarboxylase negatieve bacteriën die in staat H ₂ S wordt de zwarte neerslag niet vormen, aangezien de zuurgraad van het mengsel stoort. Daarom wordt aanbevolen om te controleren met andere media die ijzer bevatten.

Interpretatie van de test

Lysine-decarboxylering

De buisjes moeten worden gelezen na 24 uur incubatie, anders bestaat het risico dat de reactie verkeerd wordt geïnterpreteerd en valse negatieven worden gerapporteerd.

Er moet aan worden herinnerd dat de eerste reactie die zal optreden de fermentatie van glucose is, daarom worden alle buisjes na 10 tot 12 uur geel.

Als aan het einde van de incubatietijd (24 uur) een gele achtergrond met een paars of paars oppervlak wordt waargenomen, is de reactie negatief. De paarse kleur van het oppervlak komt overeen met de alkalisatie van het medium door het gebruik van peptonen.

Een positieve reactie is er een waarbij de onderkant en het oppervlak van de buis volledig paars zijn, dat wil zeggen dat het terugkeert naar de oorspronkelijke kleur.

Wie de positiviteit van de test bepaalt, is daarom de basis of achtergrond van het medium. Bij twijfel over de kleur kan deze worden vergeleken met een niet-geïnoculeerde LIA-buis.

Deaminering van lysine

Een buis die lysinedeaminering vertoont, heeft een roodachtig kastanjebruin oppervlak en een gele (zure) achtergrond, of de hele buis roodachtig kastanjebruin.

Deze reactie wordt geïnterpreteerd als negatief voor lysinedecarboxylering, maar positief voor lysinedeaminering.

Deze reactie wordt gedefinieerd en geïnterpreteerd op de ring.

Productie van waterstofsulfide (H.

Een positieve reactie wordt waargenomen door het verschijnen van een zwart neerslag in het gehele medium of een deel ervan. Meestal tussen de rand van de afschuining en de basis.

Als het neerslag door de hele buis heen voorkomt, zal het de andere reacties die in het midden optreden niet onthullen.

Overzicht van resultaten

Bij het interpreteren van de test worden de resultaten als volgt vastgelegd:

Eerst wordt de afschuining gelezen, dan de bodem of het blok, dan de productie van H ₂ S en tenslotte de productie van gas.

Voorbeeld: K / A + (-). Dit betekent:

• K: Alkaline ring (paarse kleur)
• A: Zure achtergrond (geel), d.w.z. negatieve decarboxyleringsreactie en negatieve deaminering.
• +: Productie van waterstofsulfide
• (-): Zonder gas.

Voorbereiding

Weeg 35 g van het gedehydrateerde ijzer-agarlysinemedium af en los op in een liter gedestilleerd water.

Verhit tot de agar volledig is opgelost, laat het een minuut koken en roer regelmatig. Verdeel 4 ml van het medium in 13/100 reageerbuisjes met katoenen dop.

Steriliseer gedurende 15 minuten in een autoclaaf bij 121 ° C. Haal uit de autoclaaf en laat schuin staan ​​zodat er een diepe basis en een korte afschuining ontstaat.

Bewaren in de koelkast 2-8 ° C. Laat het opwarmen voordat u de bacteriestam zaait.

De kleur van het gedehydrateerde medium is beige en het bereide medium is roodachtig paars.

De uiteindelijke pH van het voorbereide medium is 6,7 ± 0,2

Het medium wordt geel bij pH 5,2 of lager, en is paars bij pH 6,5 en hoger.

Toepassingen

Deze test wordt, samen met andere biochemische tests, gebruikt voor de identificatie van bacillen van de Enterobacteriaceae-familie.

Het medium wordt bezaaid met een rechte lus of naald, een of twee lekke banden worden gemaakt tot aan de onderkant van de buis en vervolgens wordt het oppervlak van het medium in een zigzag gekerfd.

Incubeer gedurende 24 uur bij 35-37 ° C in aerobiose. Laat het indien nodig nog eens 24 uur incuberen.

Het is vooral nuttig om lactose-negatieve Citrobacter-soorten te onderscheiden van Salmonellas sp.

Bron: Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Microbiologische diagnose. 5e druk. Redactioneel Panamericana SA Argentina.

Referenties

1. Mac Faddin J. (2003). Biochemische tests voor de identificatie van bacteriën van klinisch belang. 3e ed. Redactioneel Panamericana. Buenos Aires. Argentinië.
2. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Bailey & Scott Microbiologische diagnose. 12 ed. Redactioneel Panamericana SA Argentina.
3. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Microbiologische diagnose. 5e druk. Redactioneel Panamericana SA Argentina.
4. Britannia Laboratories. Lysine-ijzer-agar. 2015 Beschikbaar op: britanialab.com
5. BD Laboratoria. BBL Lysine IJzer Agar Slants. 2007. Beschikbaar op: bd.com
6. Valtek Laboratoria. Medium LIA 2009 Beschikbaar op: andinamedica.com