RESTRICTIE-ENZYMEN: FUNCTIES, TYPEN EN VOORBEELDEN - BIOLOGIE - 2025

De restrictie-enzymen zijn endonucleasen die door bepaalde archaea en bacteriën worden gebruikt om de verspreiding van virussen binnenin te remmen of "te beperken". Ze komen vooral veel voor bij bacteriën en maken deel uit van hun afweersysteem tegen vreemd DNA, bekend als het restrictie- / modificatiesysteem.

Deze enzymen katalyseren de splitsing van dubbelband-DNA op specifieke locaties, reproduceerbaar en zonder het gebruik van extra energie. De meeste vereisen de aanwezigheid van cofactoren zoals magnesium of andere tweewaardige kationen, hoewel sommige ook ATP of S-adenosylmethionine vereisen.

HindIII restrictie-enzymreactieschema (Bron: Helixitta via Wikimedia Commons)

Restrictie-endonucleasen werden in 1978 ontdekt door Daniel Nathans, Arber Werner en Hamilton Smith, die voor hun ontdekking de Nobelprijs voor de geneeskunde ontvingen. Hun naam is over het algemeen afgeleid van het organisme waar ze voor het eerst werden waargenomen.

Dergelijke enzymen worden veel gebruikt bij de ontwikkeling van methoden voor het klonen van DNA en andere strategieën voor moleculaire biologie en genetische manipulatie. Hun specifieke karakteristieken van sequentieherkenning en het vermogen om sequenties dicht bij herkenningssites te knippen, maken ze tot krachtige instrumenten voor genetische experimenten.

Fragmenten die zijn gegenereerd door restrictie-enzymen die inwerken op een bepaald DNA-molecuul, kunnen worden gebruikt om een ​​"kaart" van het oorspronkelijke molecuul te maken door informatie te gebruiken over de plaatsen waar het enzym DNA heeft geknipt.

Sommige restrictie-enzymen hebben misschien dezelfde herkenningsplaats op DNA, maar ze knippen het niet noodzakelijk op dezelfde manier. Er zijn dus enzymen die snijden en stompe uiteinden achterlaten en enzymen die snijden en cohesieve uiteinden achterlaten, die verschillende toepassingen hebben in de moleculaire biologie.

Momenteel zijn er honderden verschillende commercieel verkrijgbare restrictie-enzymen, aangeboden door verschillende commerciële huizen; Deze enzymen functioneren als "aangepaste" moleculaire schaar voor verschillende doeleinden.

Kenmerken

Restrictie-enzymen vervullen de tegenovergestelde functie van polymerasen, omdat ze de esterbinding binnen de fosfodiësterbinding tussen aangrenzende nucleotiden in een nucleotideketen hydrolyseren of verbreken.

In de moleculaire biologie en genetische manipulatie zijn het veelgebruikte instrumenten voor de constructie van expressie- en kloneringsvectoren, evenals voor de identificatie van specifieke sequenties. Ze zijn ook nuttig voor de constructie van recombinante genomen en hebben een groot biotechnologisch potentieel.

Recente vorderingen in gentherapie maken momenteel gebruik van restrictie-enzymen voor de introductie van bepaalde genen in vectoren die dragers zijn voor het transport van dergelijke genen naar levende cellen, en die waarschijnlijk het vermogen hebben om in te voegen in het cellulaire genoom om te presteren. permanente veranderingen.

Werkingsmechanisme

Restrictie-enzymen kunnen dubbelbandige DNA-splitsing katalyseren, hoewel sommige in staat zijn om enkelbandige DNA-sequenties en zelfs RNA te herkennen. Het snijden vindt plaats na herkenning van de sequenties.

Het werkingsmechanisme bestaat uit de hydrolyse van de fosfodiësterbinding tussen een fosfaatgroep en een deoxyribose in het skelet van elke DNA-streng. Veel van de enzymen kunnen snijden op dezelfde plaats die ze herkennen, terwijl andere tussen de 5 en 9 basenparen ervoor of erna snijden.

Deze enzymen snijden normaal gesproken aan het 5'-uiteinde van de fosfaatgroep, waardoor DNA-fragmenten ontstaan ​​met een 5'-fosforyl-uiteinde en een 3'-terminaal hydroxyl-uiteinde.

Omdat eiwitten niet in direct contact komen met de herkenningsplaats in het DNA, moeten ze achtereenvolgens worden getransloceerd totdat de specifieke plaats is bereikt, misschien door middel van "glijdende" mechanismen op de DNA-streng.

Tijdens enzymatische splitsing wordt de fosfodiësterbinding van elk van de DNA-strengen gepositioneerd binnen een van de actieve plaatsen van restrictie-enzymen. Wanneer het enzym de herkennings- en splitsingsplaats verlaat, doet het dit via niet-specifieke tijdelijke associaties.

Soorten

Er zijn momenteel vijf soorten restrictie-enzymen bekend. Hier is een korte beschrijving van elk:

Type I restrictie-enzymen

Deze enzymen zijn grote pentamere eiwitten met drie subeenheden, één voor restrictie, één voor methylering en één voor sequentieherkenning in DNA. Deze endonucleasen zijn multifunctionele eiwitten die in staat zijn om restrictie- en modificatiereacties te katalyseren, ze hebben ATPase-activiteit en ook DNA-topoisomerase.

Enzymen van dit type waren de eerste endonucleasen die werden ontdekt, ze werden voor het eerst gezuiverd in de jaren zestig en zijn sindsdien grondig bestudeerd.

Type I-enzymen worden niet algemeen gebruikt als een biotechnologisch hulpmiddel, aangezien de splitsingsplaats zich op een variabele afstand van maximaal 1000 basenparen van de herkenningsplaats kan bevinden, waardoor ze onbetrouwbaar zijn in termen van experimentele reproduceerbaarheid.

Type II restrictie-enzymen

Het zijn enzymen die zijn samengesteld uit homodimeren of tetrameren die DNA knippen op gedefinieerde plaatsen tussen 4 en 8 bp lang. Deze splitsingsplaatsen zijn typisch palindroom, dat wil zeggen dat ze sequenties herkennen die in beide richtingen op dezelfde manier worden gelezen.

Veel van de type II restrictie-enzymen in bacteriën knippen DNA wanneer ze het vreemde karakter ervan herkennen, omdat het niet de typische modificaties heeft die zijn eigen DNA zou moeten hebben.

Dit zijn de eenvoudigste restrictie-enzymen omdat ze geen andere cofactor nodig hebben dan magnesium (Mg +) om DNA-sequenties te herkennen en te knippen.

De precisie van type II restrictie-enzymen bij het herkennen en knippen van eenvoudige sequenties in DNA op precieze posities, maakt ze een van de meest gebruikte en onmisbare in de meeste takken van de moleculaire biologie.

Binnen de groep van type II restrictie-enzymen zijn er meerdere subklassen die zijn ingedeeld volgens bepaalde eigenschappen die uniek zijn voor elk. De classificatie van deze enzymen gebeurt door letters van het alfabet toe te voegen, van A tot Z achter de naam van het enzym.

Enkele van de subklassen die het meest bekend staan ​​om hun bruikbaarheid zijn:

Subklasse IIA

Het zijn dimeren van verschillende subeenheden. Ze herkennen asymmetrische sequenties en worden gebruikt als ideale voorlopers voor het genereren van snij-enzymen.

Subklasse IIB

Ze bestaan ​​uit een of meer dimeren en knippen DNA aan beide zijden van de herkenningssequentie. Ze sneden beide strengen DNA een interval van een basenpaar voor de herkenningsplaats.

Subklasse IIC

Enzymen van dit type zijn polypeptiden met functies voor deling en modificatie van DNA-strengen. Deze enzymen snijden beide strengen asymmetrisch door.

Subklasse IIE

De enzymen van deze subklasse worden het meest gebruikt bij genetische manipulatie. Ze hebben een katalytische plaats en vereisen in het algemeen een allosterische effector. Deze enzymen moeten een interactie aangaan met twee kopieën van hun herkenningssequentie om een ​​efficiënte splitsing uit te voeren. Binnen deze subklasse vallen de enzymen EcoRII en EcoRI.

Type III restrictie-enzymen

Type III restrictie-endonucleasen zijn samengesteld uit slechts twee subeenheden, de ene is verantwoordelijk voor DNA-herkenning en modificatie, terwijl de andere verantwoordelijk is voor sequentiesplitsing.

Deze enzymen hebben twee cofactoren nodig voor hun functie: ATP en magnesium. Restrictie-enzymen van dit type bezitten twee asymmetrische herkenningsplaatsen, translokeren DNA op een ATP-afhankelijke manier en knippen het tussen 20-30 bp grenzend aan de herkenningsplaats.

Type IV restrictie-enzymen

Type IV-enzymen zijn gemakkelijk te identificeren omdat ze DNA met methyleringsmerktekens knippen, ze bestaan ​​uit verschillende subeenheden die verantwoordelijk zijn voor het herkennen en knippen van de DNA-sequentie. Deze enzymen gebruiken GTP en tweewaardig magnesium als cofactoren.

Specifieke splitsingsplaatsen omvatten nucleotidestrengen met gemethyleerde of gehydroxymethyleerde cytosineresiduen op één of beide nucleïnezuurstrengen.

Type V restrictie-enzymen

Deze classificatie groepeert de enzymen van het CRISPER-Cas-type, die specifieke DNA-sequenties van binnenvallende organismen identificeren en knippen. Cas-enzymen gebruiken een streng CRISPER gesynthetiseerd gids-RNA om binnendringende organismen te herkennen en aan te vallen.

Enzymen geclassificeerd als type V zijn polypeptiden gestructureerd door type I, II en II enzymen. Ze kunnen delen van het DNA van bijna elk organisme en met een breed scala aan lengtes knippen. Hun flexibiliteit en gebruiksgemak maken deze enzymen tot een van de meest gebruikte instrumenten in genetische manipulatie, samen met type II-enzymen.

Voorbeelden

Restrictie-enzymen zijn gebruikt voor de detectie van DNA-polymorfismen, vooral in genetische populatieonderzoeken en evolutionaire onderzoeken met mitochondriaal DNA, om informatie te verkrijgen over de snelheid van nucleotidesubstituties.

Momenteel bezitten de vectoren die worden gebruikt voor de transformatie van bacteriën voor verschillende doeleinden, multikloneringsplaatsen waar herkenningsplaatsen voor meerdere restrictie-enzymen worden gevonden.

Onder deze enzymen zijn de meest populaire EcoRI, II, III, IV en V, verkregen en voor het eerst beschreven uit E. coli; HindIII van H. influenzae en BamHI van B. amyloliquefaciens.

Referenties

1. Bickle, TA en Kruger, DH (1993). Biologie van DNA-beperking. Microbiological Reviews, 57 (2), 434-450.
2. Boyaval, P., Moineau, S., Romero, DA, en Horvath, P. (2007). CRISPR biedt verworven resistentie tegen virussen in prokaryoten. Science, 315 (maart), 1709-1713.
3. Goodsell, D. (2002). Het moleculaire perspectief: restrictie-endonucleasen. Stamcellen Fundamentals of Cancer Medicine, 20, 190-191.
4. Halford, SE (2001). Hoppen, springen en lussen door restrictie-enzymen. Biochemical Society Transactions, 29, 363-373.
5. Jeltsch, A. (2003). Behoud van soortidentiteit en beheersing van soortvorming van bacteriën: een nieuwe functie voor restrictie- / modificatiesystemen? Gene, 317, 13-16.
6. Krebs, J., Goldstein, E., & Kilpatrick, S. (2018). Lewin's Genes XII (12 ed.). Burlington, Massachusetts: Jones & Bartlett Learning.
7. Li, Y., Pan, S., Zhang, Y., Ren, M., Feng, M., Peng, N.,… Zij, Q. (2015). Gebruikmaken van Type I en Type III CRISPR-Cas-systemen voor genoombewerking. Nucleic Acids Research, 1–12.
8. Loenen, WAM, Dryden, DTF, Raleigh, EA, & Wilson, GG (2013). Type I restrictie-enzymen en hun familieleden. Nucleic Acids Research, 1–25.
9. Nathans, D., & Smith, HO (1975). Restrictie-endonucleasen bij de analyse en herstructurering van DNA-moleculen. Annu. Rev. Biochem. , 273-293.
10. Nei, M. en Tajima, F. (1981). Dna-polymorfisme detecteerbaar door restrictie-endonucleasen. Genetics, 145-163.
11. Pingoud, A., Fuxreiter, M., Pingoud, V., & Wende, W. (2005). Cellulaire en moleculaire levenswetenschappen Type II restrictie-endonucleasen: structuur en mechanisme. CMLS Cellular and Molecular Life Sciences, 62, 685-707.
12. Roberts, R. (2005). Hoe restrictie-enzymen de werkpaarden van de moleculaire biologie werden. PNAS, 102 (17), 5905-5908.
13. Roberts, RJ en Murray, K. (1976). Restrictie-endonucleasen. Critical Reviews in Biochemistry, (november), 123-164.
14. Stoddard, BL (2005). Homing endonuclease structuur en functie. Quarterly Reviews of Biophysics, 1-47.
15. Tock, MR en Dryden, DTF (2005). De biologie van beperking en anti-beperking. Current Opinion in Microbiology, 8, 466-472. https://doi.org/10.1016/j.mib.2005.06.003
16. Wilson, GG en Murray, NE (1991). Beperkings- en wijzigingssystemen. Annu. Rev. Genet. , 25, 585-627.
17. Wu, Z., & Mou, K. (2016). Genomische inzichten in de virulentie van Campylobacter jejuni en populatiegenetica. Infec. Dis. Vert. Med., 2 (3), 109-119.
18. Yuan, R. (1981). Structuur en mechanisme van multifunctionele restrictie-endonucleasen. Annu. Rev. Biochem. , 50, 285-315.