UREUMBOUILLON: BASIS, BEREIDING EN TOEPASSINGEN - BIOLOGIE - 2025

De ureumbouillon is een vloeibaar kweekmedium dat wordt gebruikt om de aanwezigheid van urease-enzym in bepaalde micro-organismen te detecteren. Urease is een microbieel enzym dat op een constitutieve manier wordt geproduceerd, dat wil zeggen dat het wordt gesynthetiseerd ongeacht of het substraat waarop het inwerkt al dan niet aanwezig is.

De functie van urease is gerelateerd aan de afbraak van organische verbindingen. Niet alle micro-organismen zijn in staat dit enzym te synthetiseren, daarom maakt de bepaling in het laboratorium het mogelijk om bepaalde bacteriestammen te identificeren en zelfs onderscheid te maken tussen soorten van hetzelfde geslacht.

Negatieve en positieve ureumtest. Bron: foto gemaakt door de auteur MSc. Marielsa Gil.

Er zijn twee soorten ureumtesten: Stuart en Christensen. Ze verschillen in samenstelling en gevoeligheid. De eerste is speciaal om een ​​grote hoeveelheid urease te laten zien die wordt geproduceerd door soorten van het geslacht Proteus.

De tweede is gevoeliger en kan kleine hoeveelheden urease detecteren die laat door andere bacteriële geslachten worden gegenereerd, zoals Klebsiella, Enterobacter, Staphylococcus, Brucella, Bordetella, Bacillus, Micrococcus, Helicobacter en Mycobacterium.

Stuart's ureumbouillon is samengesteld uit ureum, natriumchloride, dikaliumfosfaat, monokaliumfosfaat, gistextract, fenolrood en gedestilleerd water.

Terwijl de ureumbouillon of agar van Christensen bestaat uit peptonen, natriumchloride, monokaliumfosfaat, glucose, ureum, fenolrood, gedestilleerd water en agar-agar. Dat laatste alleen als het het vaste medium is.

Basis

Het enzym urease hydrolyseert ureum om kooldioxide, water en twee moleculen ammoniak te vormen. Deze verbindingen reageren om het eindproduct te vormen dat ammoniumcarbonaat wordt genoemd.

Stuart's ureumbouillon

Stuart's ureumbouillon is meer gebufferd met een pH van 6,8. Daarom moet het micro-organisme grote hoeveelheden ammoniak kunnen vormen om fenolrood te kleuren. De pH moet boven de 8 komen.

Daarom is de ureumbouillon van Stuart selectief voor Proteus-soorten, met positieve resultaten binnen 24 tot 48 uur na incubatie, en is het niet effectief voor bacteriën die kleine hoeveelheden urease produceren of die ureum langzaam hydrolyseren.

Dit komt omdat Proteus-soorten ureum als stikstofbron kunnen gebruiken. In plaats daarvan hebben andere urease-producerende bacteriën een extra bron nodig.

Pérez et al. (2002) stelden vast dat de ureumbouillon van Stuart even efficiënt was als de ureumagar van Christensen bij het bepalen van urease in giststammen van de geslachten Candida, Cryptococcus, Rhodotorula, Trichosporon en Saccharomyces.

De auteurs van het onderzoek beweren 100% overeenstemming te hebben bereikt met beide media (Stuart en Christensen) bij het incuberen gedurende 24 en 48 uur; met de uitzondering dat de soorten die erin slaagden de media in een sterke roze-fuchsia kleur te veranderen, als positief werden beschouwd.

Deze verduidelijking is nodig, aangezien Lodder (1970) stelde dat bijna alle gisten erin slagen om de Christensen ureumagar-afschuining bleekroze te kleuren. Dit komt door het feit dat ze ureum in minimale hoeveelheden kunnen hydrolyseren en door de vorming van aminen door oxidatieve decarboxylering van aminozuren op het oppervlak. Dit moet niet als positief worden opgevat.

Christensen's ureumagar of bouillon

De ureumbouillon of agar van Christensen is minder gebufferd en kan kleine hoeveelheden ammoniak detecteren. Verder is dit medium verrijkt met peptonen en glucose. Deze verbindingen zorgen ervoor dat andere urease-producerende micro-organismen groeien die niet groeien in Stuart-bouillon.

Evenzo biedt de Christensen ureumtest snellere resultaten, vooral voor Proteus, die sterk positief kan zijn in slechts 30 minuten als minimale tijd en tot 6 uur als maximale tijd.

De rest van de urease-producerende micro-organismen slagen erin om de kleur van het medium lichtjes te veranderen na 6 uur, en sterk na 24, 48, 72 uur of meer, en zelfs sommige stammen kunnen zwakke reacties geven na 5 of 6 dagen.

Interpretatie van beide media (Stuart en Christensen)

Het medium is oorspronkelijk geeloranje van kleur en een positieve reactie zal de kleur van het medium veranderen in roze-fuchsia. De intensiteit van de kleur is recht evenredig met de hoeveelheid geproduceerde ammoniak.

Een negatieve reactie zal het medium met de oorspronkelijke kleur verlaten, met uitzondering van gisten, die lichtroze kunnen worden op Christensen's ureumagarmedium.

Voorbereiding

Stuart's ureumbouillon

Weeg de benodigde grammen af ​​volgens de aanwijzingen van het handelsbedrijf. Oplossen in bij voorkeur steriel gedestilleerd water. Gebruik geen warmte om op te lossen, omdat ureum gevoelig is voor warmte.

Membraanfiltratie wordt gebruikt om te steriliseren. Hiervoor wordt een Millipore-filter met poriën van 0,45 µdiameter gebruikt. Gebruik geen autoclaaf. Nadat de oplossing is gefilterd, wordt deze in steriele buisjes verdeeld. Om betrouwbare resultaten te verkrijgen, moet het worden overgebracht tussen 1,5 ml als minimale hoeveelheid en 3 ml als maximale hoeveelheid per buis.

Bewaar in de koelkast en warm voor gebruik.

Als de filtratiemethode niet beschikbaar is, moet het medium onmiddellijk worden gebruikt om betrouwbare resultaten te verkrijgen.

Een andere manier om Stuart's Urea Broth te bereiden is als volgt:

Sommige commerciële huizen verkopen het basismedium voor de ureumtest, exclusief ureum.

De door het handelsbedrijf aangegeven hoeveelheid wordt gewogen. Het wordt opgelost in gedestilleerd water en gedurende 15 minuten gesteriliseerd in de autoclaaf bij 121 ° C. Laat het een beetje rusten en voeg als het medium warm is 100 ml van een ureumoplossing toe, bereid met 20% en gesteriliseerd door middel van filtratie.

Het wordt verdeeld in steriele buisjes, zoals eerder beschreven.

Christensen's ureumagar of bouillon

-Voorbereiding van de ureumoplossing

Weeg 29 g gedehydrateerde ureum af en los op in 100 ml gedestilleerd water. Gebruik de filtratiemethode om te steriliseren. Niet autoclaveren.

-Urea-agar

Los 24 g van de gedehydrateerde basisagar op in 950 ml gedestilleerd water. Steriliseer gedurende 15 minuten in de autoclaaf bij 121 ° C. Laat het rusten tot het een temperatuur van 50 ° C heeft bereikt en voeg het eerder bereide ureum aseptisch toe.

Giet 4-5 ml in steriele buisjes en kantel tot vast. Er moet een lange fluitbek zijn.

Dit medium kan ook in vloeibare vorm worden bereid.

Toepassingen

De ureumtest is buitengewoon effectief om het geslacht Proteus te onderscheiden van andere geslachten in de familie Enterobacteriaceae, gezien de snelle reactie van Proteus.

Met behulp van de Christensen-samenstelling helpt de test om onderscheid te maken tussen soorten van hetzelfde geslacht. S. haemolyticus en S. warneri zijn bijvoorbeeld coagulase-negatief en beta-hemolytische Staphylococcus, maar verschillen doordat S. haemolyticus ureumnegatief is en S. warneri ureumpositief.

Anderzijds gebruikte McNulty met succes Christensen's 2% ureumbouillon om de aanwezigheid van Helicobacter pylori in biopsiemonsters uit het maagslijmvlies (antrale regio) te bestuderen.

De aanwezigheid van H. pylori wordt bewezen door een positieve ureumtest. De duur van het observeren van de resultaten is recht evenredig met de hoeveelheid aanwezige micro-organismen.

Zoals te zien is, is het een eenvoudige methode voor de diagnose van Helicobacter pylori in maagbiopsieën.

Ten slotte is deze test ook nuttig om soorten te onderscheiden van de geslachten Brucella, Bordetella, Bacillus, Micrococcus en Mycobacteria.

De ureumtest zaaien

Beide methoden vereisen een sterk microbieel inoculum om de resultaten te optimaliseren. Bacteriekolonies worden bij voorkeur genomen uit bloedagar en gisten uit Sabouraud-agar, op enkele uitzonderingen na. Het inoculum wordt geëmulgeerd in het vloeibare medium.

Voor de ureumbouillon van Stuart, incubeer je 24 tot 48 uur bij 37 ºC, wetende dat je alleen Proteus-stammen zoekt als de stam een ​​bacterie is. Voor gisten kan het worden geïncubeerd bij 37 ° C of bij kamertemperatuur gedurende 24 tot 48 uur incubatie.

In het geval van de ureumbouillon van Christensen, wordt deze 24 uur bij 37 ºC geïncubeerd. Als de test negatief is, kan deze maximaal 6 dagen worden geïncubeerd. Als de test binnen 6 uur positief is, geeft dit aan dat het een stam is van het geslacht Proteus.

In het geval van de ureumagar van Christensen is de agar-afschuining sterk geïnoculeerd, zonder te prikken. De bouillon wordt op dezelfde manier geïncubeerd en geïnterpreteerd.

QA

Controlestammen zoals Proteus mirabilis ATCC 43071, Klebsiella pneumoniae ATCC 7006003, Escherichia coli ATCC 25922 en Salmonella typhimurium kunnen worden gebruikt om het medium te testen. De eerste twee zouden positieve resultaten moeten opleveren en de laatste twee negatieve resultaten.

Bron: Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Microbiologische diagnose. 5e druk. Redactioneel Panamericana SA Argentina.

Referenties

1. Pérez C, Goitía K., Mata S, Hartung C, Colella M, Reyes H. et al. Gebruik van Stuart's ureumbouillon voor de ureasetest, als test bij de diagnose van gist. Rev. Soc. Ven. Microbiol. 2002; 22 (2): 136-140. Beschikbaar op: Scielo.org.
2. Mac Faddin J. (2003). Biochemische tests voor de identificatie van bacteriën van klinisch belang. 3e ed. Redactioneel Panamericana. Buenos Aires. Argentinië.
3. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Bailey & Scott Microbiologische diagnose. 12 ed. Redactioneel Panamericana SA Argentina.
4. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Microbiologische diagnose. 5e druk. Redactioneel Panamericana SA Argentina.
5. Britannia Laboratories. Christensen Medium (ureumagarbasis) 2015 Beschikbaar op: britanialab.com